Molekylära uttryck mikroskopi Primer: specialiserade mikroskopi tekniker-fluorescens Digital Bildgalleri-Madin-Darby hund njure epitelceller (MDCK)

härledd av S. H. Madin och N. B. Darby från njurvävnaden hos en vuxen kvinnlig cocker spaniel, har MDCK-cellinjen sitt ursprung i September 1958. Sedan dess har cellerna använts i stor utsträckning för att undersöka bearbetningen av beta-amyloidprekursorprotein, liksom sorteringen av dess proteolytiska produkter.

morfologin för MDCK-cellinjen är epitelial, och cellerna är positiva för keratin genom immunoperoxidasfärgning. Virus som MDCK-celler är mottagliga för inkluderar vesikulär stomatit (Indiana-stam), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 och 3, adenovirus 4 och 5, vesikulärt exantem hos svin och infektiös hundhepatit. Cellerna uppvisar resistens mot coxsackievirus B3 och B4 samt poliovirus 2 och är negativa för omvänt transkriptas.

MDCK-linjen används vanligtvis som en allmän modell för epitelceller, som omfattar den typ av vävnad som kallas epitel. Huvudsakligen finns täcker de inre organen och andra ytor av kroppen, epitel består av tätt packade celler som är organiserade i ark. Dessa celler utsöndrar en extracellulär matris som kallas basal lamina vid basen, vilket hjälper till att förankra epitelvävnaden till intilliggande vävnader. Epitelceller saknar också direkt tillgång till blodkärl och måste därför få syre och näringsämnen genom diffusion, på samma sätt som de tvingas befria sig från metaboliska avfallsprodukter. Epithelia fungerar i en mängd olika mekanismer, inklusive skydd, absorption, sensorisk mottagning och utsöndring. Njurens epitelceller spelar en nyckelroll i tillfällig lagring och efterföljande utsöndring av excretionsmaterial.

kulturen av Madin-Darby canine kidney-celler som presenterades i den digitala bilden ovan märktes med DAPI och Alexa Fluor 568 konjugerad till falloidin, som riktar sig mot DNA i cellkärnan respektive f-aktincytoskeletala nätverket. Dessutom transfekterades cellerna med en Peyfp-mitokondrier (förstärkt gult fluorescerande protein) chimär plasmid subcellulär lokaliseringsvektor. Bilder registrerades i gråskala med ett QImaging Retiga Fast-EXi-kamerasystem kopplat till ett Olympus BX-51-mikroskop utrustat med bandpassemissionsflysrörsfilter optiska block som tillhandahålls av Omega Optical. Under bearbetningssteget pseudokolorerades enskilda bildkanaler med RGB-värden motsvarande var och en av spektralprofilerna för fluorofor.

MDCK epitelceller med MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 och DAPI – en vidhäftande kultur av Madin-Darby canine njurceller märktes för det intracellulära mitokondriella nätverket och för filamentös aktin med MitoTracker Red CMXRos respektive Alexa Fluor 488 konjugerad till falloidin. Den ultravioletta absorberande sonden DAPI användes för att motverka DNA.

inriktning på peroxisomer och Klatrinproteiner i Madin-Darby njurceller med immunofluorescens – i detta avsnitt märktes den presenterade kulturen av MDCK-celler immunofluorescerande med primära antiklatrin (tung kedja) musmonoklonala antikroppar följt av get-anti-mus Fab-fragment konjugerade till cyaninfärgämnet Cy3 för att rikta in sig på det cytoskeletala nätverket. Dessutom var peroxisomer närvarande i kulturen immunofluorescerande märkta med Cy2 konjugerade till Get sekundära antikroppar riktade mot kanin anti-PMP 70 (peroxisomal membranprotein 70) primära antikroppar. Kärnorna motsattes med Hoechst 33342.

förbättrad gul Protein subcellulär lokalisering av mitokondrier i MDCK – cellkulturer-en kultur av Madin-Darby hund njure epitelceller transfekterades med en peyfp-mitokondrier (förstärkt gult fluorescerande protein) chimär plasmid subcellulär lokaliseringsvektor. Cellerna färgades också med SYTOX Orange och Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin, riktad mot DNA respektive cytoskeletala filamentösa aktinätverk.

immunofluorescens inriktning av histoner och Golgi komplex i hund njure Epitelcellkulturer – Madin-Darby hund njurceller fixerades med paraformaldehyd, permeabiliserade, och behandlades med en blandning av kanin (anti-giantin) och mus (anti-histoner, pan) primära antikroppar, följt av sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 488 och Texas Red, respektive. Den sekundära antikroppscocktailen innehöll också Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin, utformad för att samtidigt rikta sig mot det filamentösa aktinätverket.

Dubbel immunofluorescens av nukleära Porkomplexproteiner och täta korsningar i Madin-Darby Canine njurceller – epitelcelltäta korsningar och nukleära porkomplexproteiner avbildades samtidigt i MDCK-celler med en cocktail av mus anti-NPCP och kanin anti-ZO-3 primära antikroppar, följt av get anti-mus och anti-kanin sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 488 respektive Alexa Fluor 568.

det mitokondriella nätverket i MDCK-celler – en vidhäftande monolagerkultur av Madin-Darby hundnjurceller märktes immunofluorescerande med primära Anti-oxphos-komplexa v-hämmarproteinantikroppar, följt av get-anti-mus Fab-fragment konjugerade till fluorescein. Kulturen färgades därefter med Alexa Fluor 568 konjugerad till falloidin för att avslöja detaljer om det filamentösa aktinätverket och DAPI för DNA i kärnan.

MDCK-celler med vetegroddar Agglutinin – lektiner är en specialiserad klass av växtproteiner som binder till specifika kolhydratgrupper bundna till proteiner eller bosatta i cellmembran. En framstående medlem av denna grupp, vetegroddar agglutinin används ofta för att lokalisera Golgi-komplexet i fluorescensmärkningsexperiment. Kulturen som illustrerades i detta avsnitt märktes med vetegroddar agglutinin konjugerad till Texas röd, liksom Alexa Fluor 488 konjugerad till falloidin och DAPI (inriktning på DNA i kärnan).

inriktning på mitokondrier med fluorescerande proteiner i Njurcellskulturer hos hundar – en halvkonfluent kultur av MDCK-celler transfekterades transient med en plasmidchimera innehållande kodningsföljden för förbättrat gult fluorescerande protein (EYFP) smält till mitokondriell inriktningssekvens från subenhet VIII av humant cytokrom C-oxidas. Efter fixering och permeabilisering motverkades cellerna för filamentöst aktin med Alexa Fluor 546 konjugerad till falloidin och för DNA med det kärnspecifika färgämnet, DAPI.

täta korsningar i Madin-Darby Canine Kidney cellkulturer – det snäva korsningsproteinet ZO-3 visualiserades genom immunofluorescens i en sammanflytande kultur av MDCK-celler. Kanin anti-ZO – 3 antikroppar riktade mot proteinet märktes med get-anti kanin sekundära Fab-fragment konjugerade till cyaninfärgämnet, Cy3. Kärnorna motsattes med den DNA-specifika fluorophore DAPI.

MDCK-vidhäftande cellkulturer med Texas Red, Alexa Fluor 488 och Alexa Fluor 350 – i ett dubbel immunofluorescensmärkningsexperiment behandlades en odling av MDCK-celler med en cocktail av mus Anti-histoner (pan) och kanin anti-PMP 70 (peroxisomalt membranprotein) primära antikroppar. Målproteinerna visualiserades därefter med get-anti-mus och anti-kanin sekundära antikroppar konjugerade till Texas Red respektive Alexa Fluor 488. Det filamentösa aktincytoskeletala nätverket motverkades med Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin.

klassiska Färgningsmönster i epitelceller i Hundnjurar – den nu traditionella och populära kombinationen av MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 konjugerad till falloidin och Hoechst 33342 användes för att tredubbla en vidhäftande kultur av MDCK-celler. Notera det ovanliga filamentösa aktinnätverket och det stora antalet mitokondrier som omger kärnorna i dessa celler.

subcellulär lokalisering av mitokondrier med fluorescerande proteiner i MDCK-celler – efter fixering och permeabilisering märktes odlingen av MDCK-celler som presenterades i detta avsnitt med propidiumjodid och Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin, som riktar sig mot DNA respektive filamentös aktin. Dessutom transfekterades cellerna först med en pEYFP-mitokondrier plasmid subcellulär lokaliseringsvektor, vilket lokaliserade en gul fluorescerande proteinmärke till det intracellulära mitokondriella nätverket.

det omfattande Tubulinnätverket i Madin-Darby Canine njurepitelceller-mikrotubuli färgades med immunofluorescens genom att behandla en fast och permeabiliserad kultur av MDCK-celler med mus-Anti-alfa-tubulin primära antikroppar följt av get-anti-musantikroppar konjugerade till Alexa Fluor 568. Kärnorna motsattes med SYTOX Green. Även om den inte avbildades i detta avsnitt märktes kulturen också med Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin.

samtidig visualisering av Klatrin, peroxisomer och kärnor i MDCK – cellkulturer-odlingen av MDCK-celler som presenterades i detta avsnitt märktes immunofluorescerande med primära monoklonala antikroppar mot klatrin (tung kedja) mus följt av get-anti-mus Fab-fragment konjugerade till cyaninfärgämnet Cy3 för att rikta in sig på det cytoskeletala nätverket. Dessutom märktes peroxisomer närvarande i kulturen immunofluorescerande med Cy2 konjugerade till Get sekundära antikroppar riktade mot kanin anti-PMP 70 (peroxisomalt membranprotein 70) primära antikroppar. Kärnorna motsattes med Hoechst 33342.

Cytokeratin Intermediate Filament Network i Canine Kidney Epithelial Cells – Cytokeratin är en vanlig och riklig komponent i intermediate filament network i epitelceller. Den vidhäftande kulturen i detta avsnitt märktes immunofluorescerande med mus-anticytokeratin (pan) primära antikroppar, följt av get-anti-mus sekundära antikroppar konjugerade till Marina Blue. Mitokondrier visualiserades med MitoTracker Red CMXRos och kärnorna färgades med SYTOX Green.

Madin-Darby Canine Kidney Cells med Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 och Hoechst 33258 – samtidig lokalisering av snäva korsningar och kärnporkomplexproteinerna (npcp) utfördes med ett dubbel immunofluorescensexperiment med MDCK-celler med användning av mus anti-NPCP och kanin anti-ZO-3 primära antikroppar. De subcellulära målen visualiserades med användning av get-anti-mus och anti-kanin sekundära antikroppar (IgG) konjugerade till Alexa Fluor 488 respektive Alexa Fluor 568. DNA i kärnorna motsattes med Hoechst 33258.

immunofluorescerande märkning av mitokondriella nätverket i MDCK – cellkulturer-Madin-Darby hund njurceller var immunofluorescerande märkta med primära mus Anti-oxphos komplex V-hämmare proteinantikroppar, följt av get anti-mus Fab fragment konjugerade till fluorescein. Kulturen färgades därefter med Alexa Fluor 568 konjugerad till falloidin för att avslöja detaljer om det filamentösa aktinätverket och DAPI för DNA i kärnan.

MitoTracker Red CMXRos, Cy2 och Hoechst 33258 i Madin-Darby Canine njurceller – en fast och permeabiliserad vidhäftande kultur av Madin-Darby canine njurceller var immunofluorescerande märkt med primära mus Anti-cytokeratin antikroppar, följt av get anti-mus Fab fragment konjugerade till cyaninfärgämnet, Cy2. Före fixering behandlades kulturen i en timme med MitoTracker Red CMXRos, och efter antikroppsbehandlingarna motverkades kärnorna med Hoechst 33258.

bindning av lektiner till Golgi-komplexet i MDCK – Epitelcellkulturer-för att visualisera lektinbindning till Golgi-komplexet i MDCK-celler behandlades en vidhäftande kultur med vetegroddar agglutinin konjugerad till Oregon Green. Cellerna motverkades därefter med Alexa Fluor 568 konjugerad till falloidin för att lokalisera det filamentösa aktinätverket och nukleinsyran fläckar DAPI för att märka DNA i kärnan.

vidhäftande MDCK-celler med Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 och Hoechst 33342 – Alexa Fluor färgämnen användes för att visualisera distribution av clathrin och det peroxisomala membranproteinet 70 (PMP 70) i en kultur av Madin-Darby canine njurepitelceller. Efter immunofluorescensreaktionerna motverkades cellerna med Hoechst 33342 för att avslöja kärnans placering.

Madin-Darby Canine Kidney Cells med MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488 och DAPI – en av de mest användbara fluorofor kombinationerna för att visualisera interna cellulära detaljer inkluderar MitoTracker Red cmxros för att rikta mitokondrier, Alexa Fluor 488 konjugerad till phalloidin för det filamentösa aktinätverket och DAPI för att lokalisera kärnorna.

visualisering av mikrotubuli-och Aktincytoskeletala nätverk i MDCK-cellkulturer-för att samtidigt visualisera både aktin-och tubulinnätverk i MDCK-celler behandlades en fast och permeabiliserad kultur med mus-alfa-tubulin primära antikroppar, följt av en cocktail av get-anti-mus sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 568 blandade med Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin. Kärnorna motsattes med SYTOX Green.

Dubbel immunofluorescens av nukleära Porkomplexproteiner och täta korsningar i Madin-Darby Canine njurceller – epitelcelltäta korsningar och nukleära porkomplexproteiner avbildades samtidigt i MDCK-celler med en cocktail av mus anti-NPCP och kanin anti-ZO-3 primära antikroppar, följt av get anti-mus och anti-kanin sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 568 respektive Alexa Fluor 488. Kärnorna motsattes med Hoechst 33258.

närhet av kärnan och Golgi – komplexet i monoskikt MDCK-cellkulturer-närheten mellan Golgi-komplexet och kärnorna i Madin-Darby canine kidney-celler undersöktes i ett dubbel immunofluorescensexperiment med mus anti-npcp (nuclear pore complex protein) och kanin anti-giantin (Golgi complex) primära antikroppar. Antikroppsmålen visualiserades med Get sekundära antikroppar konjugerade till Alexa Fluor 568 respektive Alexa Fluor 488, medan aktincytoskeletala ramverket märktes med Alexa Fluor 350 konjugerad till falloidin.