Epstein-Barr Virus (EBV-) Zvěčněn Lymfoblastoidních Buněčných Linií (LCLs) Vyjádřit Vysokou Úroveň CD23, ale Nízké CD27 na Podporu Jejich Růstu

Abstrakt

Epstein-Barr virus (EBV) je jedním z běžných lidský herpesvirus typy na světě. Je známo, že EBV infikuje více než 95% dospělých na světě. Virus infikuje hlavně B lymfocyty a může zvěčnit a přeměnit buňky na lymfoblastoidní buněčné linie nesoucí EBV (LCL). Omezené studie byly zaměřeny na charakterizaci exprese povrchových markerů zvěčněných LCL. Tato studie demonstruje generaci 15 LCL od šestnácti pacientů s revmatoidní artritidou (RA)a zdravého dobrovolníka pomocí EBV odvozeného od kosmanů B95-8. Úspěšnost LCL generace byla 88,23%. Všechny CD19+ LCLs vyjádřil CD23 (16.94-58.9%) a CD27 (15.74-80.89%) na povrchu buněk. Naše data prokázala dvě odlišné kategorie LCL (rychle a pomalu rostoucí) (p<0.05) na základě jejich doby zdvojnásobení. Pomalu rostoucí LCLs ukázal nižší CD23 úrovni (35.28%) ve srovnání s rychle rostoucí LCLs (42.39%). Naproti tomu pomalu rostoucí LCL vykazovaly vyšší procento jak v samotném CD27, tak v kombinaci CD23+CD27+. Celkově tato zjištění mohou naznačovat korelace buněčné exprese CD23 a CD27 s mírou proliferace generovaných LCL. Zvýšení exprese CD23 může hrát roli při EBV zvěčnění B-buněk a růstu a udržování EBV transformovaných LCL, zatímco exprese CD27 může mít inhibiční účinky na proliferaci LCL. Další vyšetřování jsou oprávněné k těmto spekulacím.

1. Úvod

virus Epstein-Barr (EBV) infikoval více než 95% dospělých po celém světě . EBV cílí hlavně a infikuje B-buňky následované epiteliálními buňkami a v menší míře CD4 T-buňkami . Infekční viriony jsou produkovány po lytické replikaci v B-buňkách a epiteliálních buňkách. Po lytickém cyklu následuje latence EBV a přetrvává v infikovaných B-buňkách po zbytek života jedince . EBV způsobuje hlavně infekční mononukleózu a je také úzce spojena s lymfoidními i epiteliálními malignitami, jako je Burkittův lymfom, Hodgkinův lymfom, karcinom nosohltanu a rakovina žaludku .

EBV infikuje B-buněk a mohl zvěčnit B-buněk a tvoří dlouhodobě roste LCLs, která důsledně vyjádřit viry . Tato metoda se používá v laboratořích zvěčnit určité lidské krve odvozené z B-buněk, které mohou být později použity jako kultura modelu pro různé studie včetně rozsáhlé lék knihovna screening, studie vakcíny, a vysokou propustnost biologických studií . Mezi všemi, EBV vyrobené z B95-8, kosman buněčné linie, se zdá být nejběžnější a účinný EBV zdroj pro B-buňky zvěčnění. V posledních desetiletích se vědci snažili zlepšit metodu nesmrtelnosti a její účinnost . Nedávno se ukázalo ,že s malou modifikací by LCL mohly být generovány z malého objemu periferní krve až 0, 1 ml. Toto zjištění je zvláště užitečné za okolností, kdy je objem vzorku omezen.

Předchozí studie prokázaly, že imunitní buňky, zejména B-lymfocytů a jejich podskupin hrát klíčovou roli v patogenezi RA . Navzdory úspěchu EBV zvěčnění B-buněk bylo málo provedeno na charakterizaci LCL a jeho srovnání s rodičovskými B-buňkami. V této studii jsme prokázali, že EBV může účinně zvěčnit B-buňky z periferní krve pacientů s RA a tvořit LCL. Pak jsme zkoumali výraz úrovně několika B-buněk subpopulace značky včetně CD23 a CD27 v obou LCLs a jejich rodičovské B-buněk. Tyto subpopulace B-buněk byly dříve spojeny s klinickým projevem pacientů s RA. Například zvýšené B-buňky exprimující CD23 byly detekovány u pacientů s RA a mohly by být blokovány monoklonálními protilátkami . Podobně bylo také snadno detekováno zvýšené množství B – buněk CD27+IgD-paměti u pacientů s aktivní RA . Na druhé straně Hu a spolupracovníci prokázali, že CD27+ B-buňky negativně korelovaly s aktivitou RA onemocnění a bylo zjištěno, že jsou u pacientů narušeny .

V této studii jsme se snažili vyhodnotit výraz úrovni CD23 a/nebo CD27 na B-buňky z Pbmc a LCLs získané od pacientů s RA. Zkoumali jsme také úroveň exprese CD23 a CD27 s ohledem na buněčný růst LCL.

2. Materiály a metody

2.1. Pacient Vzorky

5 ml periferní krve od šestnácti pacientů s RA (Tabulka 1) bylo odebráno od Sunway Medical Centre, Malajsie, pod etický kód schválení z 011/2017/ER. Pbmc byly izolovány metodou Ficoll-Paque (GE Healthcare). Krátce byla krev odebraná v EDTA zkumavce zředěna 1: 1 sterilním fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a vrstvena na roztok Ficoll-Paque v čerstvé odstředivkové zkumavce. Zkumavka byla odstředěna při 400 xg po dobu 40 minut při pokojové teplotě s nízkou akcelerací a „brzděním“. Horní vrstva, která je plazma byla odebrána a aliquoted před uložením při teplotě -80°C. buffy coat obsahující PBMCs byly shromážděny pomocí 3 ml Pasteurovou pipetou a přenesena do nové centrifugační zkumavky. Buňky byly dvakrát promyty PBS následovaným RPMI médiem obsahujícím 10% fetálního bovinního séra (FBS), před kryokonzervací v 10% DMSO a skladováním v nádrži na kapalný dusík. 5 ml krve bylo darováno od zdravého dobrovolníka jako kontrola. Pbmc a plazma byly zpracovány a uloženy, jak je popsáno výše. Datum diagnózy, odběr vzorků krve, kryokonzervace PBMCs a nesmrtelnost EBV jsou uvedeny v doplňkových materiálech (k dispozici zde).

2.2. Krevní Test a výpočet aktivity onemocnění

2.3. EBV Zvěčnění

B95-8 kosman-odvozené EBV supernatant byl jakýsi dar od Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Molekulární Patologie jednotky, Ústav pro Lékařský Výzkum (IMR), Malajsie. B-buňky z periferní krve pacienta byly zvěčněny pomocí koncentrovaného supernatantu EBV, jak bylo popsáno výše . Tabulka v doplňkových materiálech uvádí datum izolace a kryokonzervace PBMC, zřízení LCLs, a trvání kryokonzervovaných Pbmc skladovaných v nádrži na kapalný dusík. Stručně řečeno, lahvička dříve kryokonzervovaného PBMC byla rozmražena a bylo stanoveno číslo buňky. Buňky byly upraveny na 2 x 106/mL pomocí čerstvě rozmražené EBV supernatant a inkubovány přes noc při 37°C, 5% CO2 za stálého T25 baňky. Následující den bylo do baňky přidáno transformační médium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml cyklosporinu). Buňky infikované EBV byly pozorovány pod mikroskopem, aby hledaly rozetově transformované LCL v klastrech. LCL v pasážích 3-6 byly použity pro analýzu průtokové cytometrie a analýzu buněčné proliferace.

2.4. Průtoková Cytometrie Analýzy

Tři barevné cytometrie byla provedena na průtokový cytometr FACSCalibur (Becton Dickinson) s použitím monoklonálních protilátek identifikace povrchových antigenů T-buněk (CD3/PE, klon SK7), B-buněk (CD19/BB515, HIB19), a B-buněk podskupin (CD23/APC, klon EBV-CS5, a CD27/PE, klon L128). Pro stanovení životaschopnosti buněk byl zakoupen roztok 7aad (VIA-PROBE). Všechny protilátky byly zakoupeny od Bectona Dickinsona. Krátce, kryokonzervované Pbmc byly rozmraženy a resuspendovány v 50µL BSA skvrna pufru (Becton Dickinson) a inkubovány při pokojové teplotě ve tmě s předředěny fluorochrome-konjugované protilátky po dobu 30 minut. Pbmc byly poté dvakrát promyty barvicím pufrem BSA a resuspendovány v 500 µl BSA pufru pro analýzu průtokové cytometrie. Stejným postupem byly připraveny kontrolní suspenze PBMC. 20,000 životaschopné buňky určuje životaschopnost buněk barvení byly uzavřené a shromažďovány pro tři-barevná analýza v sad CD3/CD19/CD23 a CD19/CD27/CD23. Data byla analyzována pomocí softwaru CellQuest Pro (Becton Dickinson).

2.5. LCLs Proliferace

oddělit LCLs do dvou kategorií (rychle a pomalu rostoucí), buněčné proliferace sazba byla stanovena pomocí RealTime-Glo MT životaschopnost buněk assay (Promega) podle pokynů výrobce. Jedná se o test založený na nelytické luminiscenci, který dokáže detekovat proliferaci živých buněk v kultuře v reálném čase až 72 hodin. Stručně, 10 000 buněk na jamku byly nasazeny na bílé ploché dno 96-well plate (Greiner Bio-one) ve trojím vyhotovení. 2X reakční směs byla připravena z dodané soupravy a přidána do každé jamky. Buňky byly inkubovány při 37°C, 5% CO2 po dobu 1 hodiny před měřením byl pořízen v různých časových bodech (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, a 72 hodin) pomocí luminiscence na mikrotitrační destičce reader (Tecan). Relativní luminiscenční jednotky (Rlu) oproti času grafu byly vyneseny ukázat růst křivky LCLs. V tomto grafu bylo číslo buňky reprezentováno RLUs. Pomocí Rlu, zdvojnásobení čas (čas potřebný pro číslo zdvojnásobit hodnotu) každé kategorie LCLs byla vypočtena pomocí multipoint on-line kalkulačky, které byly použity pro testy významnosti . Tento Online nástroj používá pro výpočet doby zdvojnásobení exponenciální metodu nejmenších čtverců. Tempo růstu (počet zdvojnásobení, které se vyskytují za jednotku času), pak byla vypočtena podle níže uvedeného vzorce:průměrná hodnota všech LCLs‘ zdvojnásobení čas byl 54.69 hodin. Proto byla tato hodnota použita jako mezní hodnota a LCLs s dobou zdvojnásobení vyšší než 54.69 hodin bylo seskupeno do pomalu rostoucích LCL a naopak pro rychle rostoucí LCL.

2.6. Statistické Analýzy

průtoková cytometrie analýza byla provedena ve třech nezávislých experimentů pro každou kategorii LCLs, pokud není uvedeno jinak. Údaje byly vyjádřeny v průměrných hodnotách směrodatných odchylek (std. rozvoj). Významnost byla stanovena pomocí neparametrických testů (Mann-Whitney a Kruskal-Wallis H), ve kterých jsou údaje považovány za významné, pokud je p menší než 0,05.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Aktivitu onemocnění Obor Subjektů

ukazuje Tabulka 1 demografické údaje z šestnácti pacientů s RA a zdravého jedince a jejich výsledky krevních testů běžně používaných RA diagnostické markery indikující jejich onemocnění činností. Na základě indexu DAS28-CRP u 16 pacientů s RA byli 3 z těchto pacientů klasifikováni jako vysoká aktivita onemocnění, 8 jako střední aktivita, 3 jako remise a zbývající dva jako neznámý stav kvůli neúplnému sběru dat.

3.2. Generace LCLs

Pbmc byly sklizeny z šestnácti pacientů s RA a jednoho zdravého dárce (označeno jako C) (Tabulka 1) a zamrazena. Alikvoty kryokonzervovaných Pbmc byly poté použity pro infekci EBV. Ze sedmnácti baněk bylo 15 EBV transformovaných LCL (kromě 4E a 14A) vygenerováno jeden týden po infekci, ve které byly z baněk vidět viditelné buněčné shluky. Při vizualizaci pod mikroskopem vykazovaly LCLs typickou morfologii růžice s různými velikostmi, jak je naznačeno červenými šipkami (Obrázek 1). Úspěšnost generace LCLs byla 88, 23% (15 ze 17).

Obrázek 1

Mikroskopické vyšetření PBMC získaných EBV-zvěčnil B-buněk RA pacienta 8A jeden týden po infekci. Tyto imortalizované buňky jsou anotovány jako LCL-8A. Červené šipky ukazují růžice-jako EBV-zvěčnil LCLs na 4x (horní panel), 10x (střední panel) a 20x (spodní panel) zvětšení. Stupnice jsou označeny žlutě.

3.3. Rychlost růstu a zdvojnásobení času výpočet generovaných LCL

poté jsme určili rychlost růstu každé generované Kategorie LCL pomocí analýzy proliferace buněk založené na luminiscenci v reálném čase. Obrázek 2 ukazuje růst křivky každé kategorie LCLs zastoupená relativních jednotkách luminiscence (Rlu). Tabulka 2 ukazuje vypočtenou dobu zdvojnásobení a rychlost růstu příslušných LCL pomocí online kalkulačky . Ze získaného času zdvojnásobení každé kategorie LCL rozdělíme LCL do dvou kategorií pomocí 54.69 hodin (střední hodnota všech LCLs) jako cut-off hodnotu, což mělo za následek 10 rychle rostoucí a 5 pomalu rostoucí LCLs (Tabulky 2 a 4) (p<0.05).

Obrázek 2

Růst křivky LCLs. Relativní luminiscenční jednotky představují signály životaschopnosti buněk v různých časových bodech. Vyplněné čáry představují rychle rostoucí LCL, zatímco tečkované čáry představují pomalu rostoucí LCL.

3.4. Surface Marker Výraz LCLs

Pbmc a odpovídající LCLs byly podrobeny průtoková cytometrie analýzy určit jejich povrch marker projevu, včetně CD3, CD19, CD23, a CD27. CD3 a CD19 jsou povrchové markery pro T-buňky a B-buňky. Použití Pbmc izolované z pacienta 8A a odpovídající LCL-8A jako příklady, Obrázek 3 ukazuje, jak CD3+ T-buňky a CD19+ B-buněk byly profilované a bránou pomocí průtokové cytometrie. Úroveň exprese byla poté uvedena v procentech z celkového počtu analyzovaných lymfocytů, což bylo 20 000 buněk. V dárcovských Pbmc, 29.78-81.8% T-buněk, zatímco 2.35-45.95% tvoří B-buňky. Po EBV transformace, T-buněčné populace snížena na 0-0.27%, zatímco B-lymfocytů se zvýšil na 68.59-89.35%. To jasně naznačuje úspěch nesmrtelnosti B-buněk EBV, která převzala populaci T-buněk. CD3+ T-buňky senesced a bude zcela smýt z LCLs.

Obrázek 3

T-buněk (CD3) a B-buněk (CD19) surface marker profilování pomocí průtokové cytometrie. Horní panel ukazuje analýzu Pbmc izolovaných od pacienta 8A, zatímco spodní panel ukazuje analýzu odpovídajících LCL (LCL-8A). R1: 7AAD – živé buňky; R2: gated lymfocyty; R3: gated CD3+ T-buňky; R4: gated CD19+ B-buňky.

CD23 je marker aktivace B-buněk, zatímco CD27 je marker pro paměťové B-buňky . U pacientů s RA bylo dříve hlášeno, že zvýšené hladiny B-buněk exprimujících CD23 pozitivně korelují s aktivitou onemocnění a mohly by potenciálně sloužit jako terapeutický cíl . Naproti tomu bylo zjištěno, že CD27+ B-buňky negativně korelují s aktivitou onemocnění a bylo zjištěno, že jsou u pacientů s RA narušeny . V současné studii jsme nemohli rozlišit vzorec exprese CD23 a CD27 v Pbmc a LCL(Tabulka 3). Obrázek 4 znázorňuje vtokové z CD19+, CD23+, a CD27+ z Pbmc izolované z pacienta 8A a odpovídající LCL-8A pomocí průtokové cytometrie. Ze všech LCLs, zatímco 68.59-89.35% CD19+, jak se očekávalo, vykazují expresi CD23 (16.94-58.9%) a CD27 (15.74-80.89%). B-buňky coexpressing CD23 a CD27 byly 5.72-41.53% (Tabulka 3).

3.5. Korelace Aktivity Onemocnění, Surface Marker Výraz Úroveň, a LCL Šíření

statistická analýza byla provedena pro testování korelace mezi aktivitou onemocnění a surface marker projevů; nicméně, žádný z nich ukázal význam. Podobně aktivita onemocnění nekorelovala s rychlostí růstu odpovídajících LCL.

Od doby zdvojnásobení každé kategorie LCLs, průměrné hodnoty pro obě rychle a pomalu rostoucí LCLs byly stanoveny a podrobeny statistické analýze. Tabulka 4 ukazuje významný rozdíl (p<0.05), pokud jde o zdvojnásobení času mezi oběma kategoriemi. Podobně byly stanoveny střední hodnoty úrovní CD23, CD27 a CD23+CD27+ příslušné kategorie. Rychle rostoucí LCLs mají vyšší expresi CD23 (42.39%) ve srovnání s pomalu rostoucí LCLs (35.28%). To však není statisticky významné (Tabulka 4). Naopak, exprese CD27 a CD23/CD27 coexpression byly nižší v rychle rostoucí LCLs (36.15 a 13.36%, v uvedeném pořadí) ve srovnání s pomalu rostoucí LCLs (51.57% a 19.49%, respektive). Když se provádí statistická analýza, pouze rychle rostoucí LCL vykazují výrazně nižší expresi CD27, ale ne CD23/CD27. K ověření těchto zjištění jsou nutné další studie s větší velikostí vzorku.

vysoká exprese CD23 může být způsobena infekcí nebo transformací EBV. Existují důkazy, které ukazují, že nesmrtelnost B-buněk se může spoléhat na buněčnou expresi CD23. Studie ukázala, že CD23-negativní B-buňky by mohly být infikovány EBV, ale nemohl být zvěčněn, pokud se doplňuje s specifické růstové faktory . Další studie ukázala, že B-buňky infikované EBV se mohou vyvinout do dvou odlišných subpopulací: CD58+IL6-a CD58+IL6+ . Bývalá subpopulace B-buněk se aktivně proliferovala, zatímco druhá subpopulace přestala proliferovat. Expresi CD23 může být také vyvolané EBV nukleární antigen 2 (EBNA-2) vyjádření po EBV transformace B-buněk jak již bylo popsáno v Burkittův lymfom (BL) buněčné linie . Naproti tomu vyšší exprese CD27 u pomalu rostoucích LCL může naznačovat jejich inhibiční účinky na proliferaci LCL.

4. Závěry

CD23 by mohly hrát stimulační roli v EBV transformaci B-buněk a růstu LCLs. Naše studie ukázaly, že rychle rostoucí LCL vykazovaly vyšší expresi CD23 a nižší expresi CD27 a expresi CD23CD27. Další studie s větší velikostí vzorku jsou oprávněné zkoumat do hloubky na důsledky surface marker výraz na EBV údržbu a buněčný růst.

dostupnost dat

údaje použité na podporu zjištění této studie jsou zahrnuty do článku.

Střet Zájmů

autoři prohlašují, že neexistují žádné střety zájmů týkající se zveřejnění tohoto článku.

Poděkování

chtěli Bychom poděkovat Dr. Alan Soo-Beng Khoo z Molekulární Patologie Jednotky, Ústav pro Lékařský Výzkum (IMR), Malajsie, za jeho velkorysost při poskytování nás s B95-8 kosman-odvozené EBV pro naše zvěčnění práce. Hooi-Yeen Yap je příjemcem Sunway University magisterského titulu výzkumným stipendiem. Tento výzkum byl financován Sunway Univerzity Interního Výzkumného Grantu 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), Národní Rada Rakovina Malajsie (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01), a Sunway Medical Centre Prostředky na Výzkum (SRC/002/2017/FR a SRC/003/2017/FR).

Doplňkové Materiály

tabulka ukazuje studoval případy s datem diagnózy, odběr krve, Pbmc kryokonzervace, EBV zvěčnění, a doba trvání kryokonzervované Pbmc. (Doplňkové Materiály)