hydrofob interaktionskromatografi (HIC) er en af de mest anvendte metoder til adskillelse og rensning af proteiner i deres oprindelige tilstand. HIC viser sig også at være ret nyttigt til isolering af proteinkomplekser og til at studere proteinfoldning og udfoldning. Hvordan virker HIC? Hvad er principperne bag denne teknik? For at forstå mekanismen bag denne type kromatografi er her nogle ting, du bestemt har brug for at vide.
Hvordan virker HIC?
i en nøddeskal adskiller HIC (også kendt som ‘saltning ud’) proteinmolekyler ved hjælp af hydrofobicitetens egenskaber. Ved denne metode påføres proteiner, der indeholder både hydrofile og hydrofobe regioner, på en hic-søjle under høje saltbufferbetingelser.
saltet i bufferen (normalt ammoniumsulfat) reducerer opløsningen af prøveopløste stoffer og udsætter de hydrofobe regioner langs overfladen af proteinmolekylet. Dette letter adsorptionen af disse hydrofobe regioner til de hydrofobe områder på den faste understøtning og udfælder (krystalliserer) proteiner ud af opløsningen.
Husk, at når du udfører denne type kromatografi, forbedrer tilsætningen af lyotrofiske salte den hydrofobe virkning og reducerer antallet og volumenet af individuelle hydrofobe hulrum, mens reduktion af saltkoncentrationen vil resultere i desorption fra den faste understøtning. Som sådan kan prøveeluering lettes gennem faldende saltgradient. Milde organiske modifikatorer eller rengøringsmidler kan også tilsættes til elueringsbufferen for at hjælpe med elueringsprocessen.
ved hjælp af HIC-principperne kan du binde proteiner fra vandige opløsninger i varierende grad afhængigt af strukturen af dit protein af interesse, saltkoncentration, pH, temperatur og organiske opløsningsmidler, der anvendes.
Hydrofob Interaktionskromatografi: Afdækning af de underliggende teorier
der er tre hovedteorier, der kan hjælpe med at forklare mekanismen bag HIC – (1) The salting out theory, (2) The termodynamic theory og (3) The overfladespænding eller Van Der Vaals kræfter teori.
saltning ud teori
ifølge saltning ud teori danner de hydrofobe aminosyrer beskyttede hydrofobe områder ved foldning i vandig opløsning, mens de hydrofile aminosyrer tillader proteiner at binde med hydrogenmolekylerne i vandet. Som et resultat vil sandsynligheden for, at proteinet opløses i vand, øges, hvis der er nok hydrofile områder til stede i overfladen af proteinmolekylerne.
ved tilsætning af anti-chaotrofiske salte (såsom ammoniumsulfat og natriumsulfat) i opløsningen vil nogle af vandmolekylerne imidlertid interagere med saltioner i stedet for den ladede del af proteinet. Når protein-protein-interaktionerne i opløsningen bliver stærkere end de opløsningsmiddelopløselige interaktioner, reagerer proteinmolekylerne frit med hinanden-så de kan aggregeres og til sidst udfældes ud af opløsningen. Derfor reducerer tilsætningen af salt i opløsningen opløseligheden af forskellige proteiner i varierende omfang.
termodynamik teori
denne teori siger, at interaktionen mellem hydrofobe molekyler er en entropidrevet proces baseret på termodynamikens anden lov. Den hydrofobe interaktion mellem to eller flere ikke-polære molekyler i en polær opløsningsmiddelopløsning er en spontan proces styret af en ændring i entropi. Sådanne interaktioner kan imidlertid ændres ved at kontrollere temperaturen eller ved at modificere opløsningsmiddelpolariteten.
som sådan, når et ikke-polært molekyle kommer i kontakt med et polært opløsningsmiddel, såsom vand, vil der være en stigning i ordensgraden af opløsningsmiddelmolekylerne omkring det hydrofobe molekyle. Så længe entalpi ikke stiger markant, vil dette give et fald i entropi og give en samlet positiv ændring i Gibbs-energien. Som sådan vil opløsningen af et ikke-polært molekyle i et polært opløsningsmiddel ikke forekomme spontant, da det ikke er termodynamisk gunstigt.
men når du sætter to eller flere ikke-polære molekyler i et polært miljø, vil de hydrofobe overflader af makromolekylerne blive skjult for den polære omgivende og de hydrofobe molekyler aggregeres spontant. De stærkt strukturerede opløsningsmiddelmolekyler, der omgiver den eksponerede overflade af de hydrofobe molekyler, forskydes mod hovedparten af opløsningsmidlet bestående af mindre strukturerede molekyler. Som følge heraf øges entropien, mens Gibbs-energien falder. Under sådanne tilfælde bliver hydrofob interaktion en termodynamisk gunstig proces.
overfladespænding, Van Der Vaals teori
denne teori antyder, at den hydrofobe interaktion i HIC er afhængig af van Der Vaals kræfter mellem proteiner og immobiliserede ligander, da disse kræfter stiger, når den ordnede struktur af vand stiger i nærvær af saltning af salte.