sekventeringsdata af høj kvalitet er en vigtig del af at sikre, at dine data er pålidelige og replikerbare, og at opnå sekventeringsdata af høj kvalitet betyder at bruge udgangsmateriale af høj kvalitet. For RNA-sek-data betyder det at bruge RNA, der har et højt Rin (RNA – Integritetsnummer), en 10-punkts skala fra 1-10, der giver et standardiseret tal til forskere, der angiver kvaliteten af deres RNA, fjerner individuel bias og fortolkning fra processen.
RIN er en signifikant forbedring i forhold til den måde, hvorpå RNA-integritet tidligere blev beregnet: 28S og 18S-forholdet. Fordi 28S er cirka 5 kb og 18S er cirka 2 kb, er det ideelle 28S:18S–forhold 2,7:1-men benchmarket betragtes som 2:1. Denne måling er imidlertid afhængig af antagelsen om, at kvaliteten af rRNA (et meget stabilt molekyle) er lineært reflekterende af mRNA-kvalitet, hvilket faktisk er meget mindre stabilt og oplever højere omsætning .
Figur 1: RNA-spor af RNA-prøver med forskellige Rin-værdier. Bemærk forskellen mellem prøver af høj og lav kvalitet.
heldigvis har Agilent Technologies udviklet en bedre metode: RIN-værdien. Agilent har udviklet en sofistikeret algoritme, der beregner Rin-værdien, en måling, der er en betydelig forbedring i forhold til 28S:18S-forholdet. RIN er en forbedring, idet den tager højde for hele RNA-prøven, ikke kun rRNA-målingerne, som du kan se i Figur 1
betydningen af RNA-integritet ved bestemmelse af kvaliteten af genekspression blev undersøgt af Chen et al. i 2014 ved at sammenligne RNA – prøver af 4 forskellige RIN-numre (fra 4,5-9,4) og 3 forskellige biblioteksforberedelsesmetoder (poly-A valgt, rRNA-udtømt og total RNA) for i alt 12 prøver. De beregnede derefter korrelationskoefficienten for genekspression mellem RNA af højeste kvalitet og de mere nedbrudte prøver mellem Bibliotekets forberedelsesmetoder.
figur 2: kun poly-A udvalgte RNA-bibliotekspræparater oplever et fald i datakvalitet med et fald i RIN-værdi.
fascinerende var den eneste biblioteksforberedelsesmetode, der viste et signifikant fald i sammenhængen mellem høj kvalitet og lav kvalitet RNA, poly-A udvalgt biblioteksforberedelsesmetode. De to andre biblioteksforberedelsesmetoder havde stadig korrelationskoefficienter på mere end 0,95 selv ved lave skylninger (se figur 2 )!
Chen et al. teoretisere, at årsagen bag dette er, at nedbrudte prøver, der er valgt poly-A, vil resultere i en stadig mere 3′ forudindtaget biblioteksforberedelse, og at du derfor mister værdifulde læsninger fra dine data. Fordi de andre metoder involverer enten ingen behandling eller fjernelse af rRNA (i modsætning til udvælgelse), vil der være betydeligt mindre bias i den samlede prøve.
selvom det ser ud til, at kun poly-A-udvalgte biblioteksforberedelsesmetode lider af at have en lav RIN, foretrækker udbydere stadig at arbejde med RNA-prøver af relativt høj kvalitet til alle biblioteksforberedelsesmetoder. Imidlertid, hvis du har vigtige prøver, der er af RIN af lavere kvalitet, det kan stadig være værd at diskutere dine muligheder direkte med en udbyder–og vi hos Genohub er mere end glade for at hjælpe med at lette dine diskussioner! Kontakt os her, hvis du har yderligere spørgsmål om sekventering af prøver med dårlig RIN.