Carbamoylphosphatsynthase (CPSase) ist ein heterodimeres Enzym, das aus einer kleinen und einer großen Untereinheit besteht (mit Ausnahme von CPSase III, die aus einem einzelnen Polypeptid besteht, das möglicherweise durch Genfusion der Glutaminase- und Synthetasedomänen entstanden ist). CPSase hat drei aktive Stellen, eine in der kleinen Untereinheit und zwei in der großen Untereinheit. Die kleine Untereinheit enthält die Glutaminbindungsstelle und katalysiert die Hydrolyse von Glutamin zu Glutamat und Ammoniak, das wiederum von der großen Kette zur Synthese von Carbamoylphosphat verwendet wird. Die kleine Untereinheit hat eine 3-lagige Beta / Beta / Alpha-Struktur und wird in den meisten Proteinen, die sie tragen, als mobil angesehen. Die C-terminale Domäne der kleinen Untereinheit der CPSase weist eine Glutaminamidotransferaseaktivität auf. Die große Untereinheit hat zwei homologe Carboxyphosphatdomänen, die beide ATP-Bindungsstellen aufweisen; Die N-terminale Carboxyphosphatdomäne katalysiert jedoch die Phosphorylierung von Biocarbonat, während die C-terminale Domäne die Phosphorylierung des Carbamat-Zwischenprodukts katalysiert. Die in der großen Untereinheit der CPSase dupliziert gefundene Carboxyphosphatdomäne ist auch in den biotinabhängigen Enzymen Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), Propionyl-CoA-Carboxylase (PCCase), Pyruvatcarboxylase (PC) und Harnstoffcarboxylase als Einzelkopie vorhanden.
Die große Untereinheit in der bakteriellen CPSase hat vier strukturelle Domänen: die Carboxyphosphatdomäne 1, die Oligomerisierungsdomäne, die Carbamoylphosphatdomäne 2 und die allosterische Domäne. CPSase-Heterodimere aus Escherichia coli enthalten zwei molekulare Tunnel: einen Ammoniaktunnel und einen Carbamattunnel. Diese domänenübergreifenden Tunnel verbinden die drei verschiedenen aktiven Zentren und fungieren als Leitungen für den Transport instabiler Reaktionszwischenprodukte (Ammoniak und Carbamat) zwischen aufeinanderfolgenden aktiven Zentren. Der katalytische Mechanismus der CPSase beinhaltet die Diffusion von Carbamat durch das Innere des Enzyms von der Stelle der Synthese innerhalb der N-terminalen Domäne der großen Untereinheit zur Stelle der Phosphorylierung innerhalb der C-terminalen Domäne.