Monoaminoxidase-A-Hemmung und damit verbundene antioxidative Aktivität in Pflanzenextrakten mit potenziellen antidepressiven Wirkungen

Zusammenfassung

Monoaminoxidase (MAO) katalysiert die oxidative Desaminierung von Aminen und Neurotransmittern und ist an Stimmungsstörungen, Depressionen, oxidativem Stress und unerwünschten pharmakologischen Reaktionen beteiligt. Diese Arbeit untersucht die Hemmung des menschlichen MAO-A durch Hypericum perforatum, Peganum harmala und Lepidium meyenii, von denen berichtet wird, dass sie die Stimmung und den psychischen Zustand verbessern und beeinflussen. Anschließend wird die mit der Hemmung von MAO verbundene antioxidative Aktivität erstmals in Pflanzenextrakten bestimmt. H. perforatum hemmte humanes MAO-A, und Extrakte aus Blüten zeigten die höchste Hemmung (IC50 von 63,6 µg / ml). Pflanzenextrakte wurden durch HPLC-DAD-MS analysiert und enthielten Pseudohypericin, Hypericin, Hyperforin, Adhyperforin, Hyperfirin und Flavonoide. Hyperforin hemmte das menschliche MAO-A nicht und Hypericin war ein schlechter Inhibitor dieses Isoenzyms. Quercetin und Flavonoide trugen signifikant zur MAO-A-Hemmung bei. P. harmala-Samenextrakte hemmten MAO-A stark (IC50 von 49,9 µg / l) und sind aufgrund ihres Gehalts an β-Carbolinalkaloiden (Harmalin und Harmin) tausendmal wirksamer als H. perforatum-Extrakte. L. Meyenii-Wurzelextrakte (Maca) hemmten MAO-A nicht. Diese Pflanzen können Schutzmaßnahmen im Zusammenhang mit antioxidativen Wirkungen ausüben. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass P. harmala- und H. perforatum-Extrakte eine antioxidative Aktivität aufweisen, die mit der Hemmung von MAO (d. H. Einer geringeren Produktion von H2O2) verbunden ist.

1. Einleitung

Das Enzym Monoaminoxidase (MAO) metabolisiert xenobiotische und endogene Amine und Neurotransmitter wie Serotonin, Dopamin, Noradrenalin, Tyramin, Tryptamin und das Neurotoxin MPTP . Es tritt als zwei Isoenzyme auf, MAO-A und MAO-B, die eine wichtige Rolle im Zentralnervensystem (ZNS) und in den peripheren Organen spielen. MAO-B ist an neurodegenerativen Erkrankungen und MAO-A an psychiatrischen Erkrankungen und Depressionen beteiligt. Inhibitoren von MAO-B sind als Neuroprotektiva nützlich, während Inhibitoren von MAO-A wirksame Antidepressiva sind, obwohl ihre Verwendung Nebenwirkungen auslösen kann (z. B. hypertensive Krise mit Lebensmitteln, die Tyramin enthalten) . Andererseits erzeugt die Oxidation von biogenen Aminen und Neurotransmittern durch MAO-Enzyme Wasserstoffperoxid (H2O2), Sauerstoffradikale und Aldehyde, die Risikofaktoren für oxidative Zellverletzungen sind. Daher kann die Hemmung von MAO zu einem Schutz vor oxidativem Stress und Neurotoxinen führen . Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Pflanzen- und Lebensmittelextrakte MAO-Enzyme hemmen können, was zu den oben genannten biologischen Wirkungen führt . Andererseits können diese Produkte infolge der MAO-Hemmung an unerwünschten Wechselwirkungen mit anderen pflanzlichen Zubereitungen, Lebensmitteln oder Arzneimitteln beteiligt sein .

Hypericum perforatum L. (Familie Hypericaceae) (Johanniskraut) wird häufig für gesundheitliche Zwecke verwendet und ihre Produkte sind im Handel als Kräuter, Nutrazeutika, Tees, Tinkturen, Säfte, ölige Mazerate, Phytopharmaka sowie Lebensmittelzusatzstoffe und Nahrungsergänzungsmittel erhältlich . H. perforatum ist beliebt für die Behandlung von leichten und mittelschweren Depressionen . Es kann unerwünschte pharmakologische Wechselwirkungen mit anderen Kräutern, Drogen oder Lebensmitteln auslösen . Seine Fähigkeit, Stimmungsstörungen und Depressionen zu lindern und zu verbessern, wird Wirkstoffen zugeschrieben, die antidepressive Eigenschaften aufweisen . Der am meisten akzeptierte Wirkungsmechanismus ist die Monoamin-Wiederaufnahmehemmung, aber zusätzliche Mechanismen, einschließlich Monoaminoxidasehemmung und synergistische Effekte, können beteiligt sein . Peganum harmala (Familie Zygophyllaceae) und Lepidium meyenii (Familie Brassicaceae) (Maca) sind Pflanzen mit ZNS-Wirkungen und potenziellen antidepressiven Wirkungen . P. harmala, gebürtig aus dem Mittelmeerraum und Asien und auf Nordamerika ausgedehnt, wird als Mehrzweck-Gesundheitsmittel einschließlich ZNS-Erkrankungen eingesetzt. Zubereitungen dieser Pflanze können unerwünschte pharmakologische Wechselwirkungen auslösen . L. meyenii ist eine essbare Pflanze aus den Zentralanden, deren Wurzeln als Nahrungsenergie und Nutrazeutikum verwendet werden, um körperliche und geistige Bedingungen und Fruchtbarkeit zu verbessern . Der Zweck dieser Arbeit war es, die Hemmung von humanem MAO-A durch Extrakte von H. perforatum, P. harmala und L. meyenii (maca) sowie durch ihre aktiven Komponenten, die durch HPLC-DAD-MS identifiziert und analysiert wurden, zu untersuchen und anschließend die antioxidative Aktivität zu bewerten, die spezifisch mit der Hemmung von MAO verbunden ist. Diese spezifische antioxidative Aktivität wird erstmals in Pflanzenextrakten bestimmt.

2. Materialien und Methoden

Hypericum perforatum L. In Ciudad Real (Spanien) gesammelte Pflanzen wurden getrocknet und in Teile getrennt: Blumen; obere oberirdische Teile der Pflanze, einschließlich verzweigter Stängel und Blätter, aber keine Blüten; und Hauptstiele (zentral und unten) und Wurzeln. Sie wurden gemahlen und das Pulver zur Probenvorbereitung verwendet. Kommerzielle Kräuter und Kräuterergänzungen (Kapseln und Tabletten) von H. perforatum wurden auch in lokalen Kräuterläden gekauft. Peganum harmala L. Pflanze und Samen wurden in Toledo (Spanien) gesammelt. Lepidium meyenii (Maca) sowohl als Pulver als auch als kommerzielle Tabletten wurden aus Peru und lokalen Geschäften bezogen. Hypericin standard (>95% purity by HPLC) from HWI Analytik GMBH pharma solutions, hyperforin dicyclohexylammonium salt, quercetin, harmaline, harmine, catalase, clorgyline, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), and horseradish peroxidase (HRP) type II were purchased from Sigma-Aldrich.

2.1. Sample Preparation of Plant Extracts

Samples containing H. perforatum (i.e., plant parts, herbal preparation, capsules, or tablets) (500 mg) were homogenized in 10 mL of water/methanol (1 : 1) unter Verwendung eines Ultra Turrax Homogenisators 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt, wobei der Rückstand und die drei überstehenden Fraktionen gesammelt, gemischt und wie unten erwähnt mittels HPLC analysiert wurden. Nach drei aufeinanderfolgenden Extraktionen waren die Wiederfindungsraten von Hypericin und Pseudohypericin höher als 97%. Proben von L. meyenii (maca) (500 mg) und P. harmala Samen (500 mg) wurden jeweils in 10 ml Wasser/Methanol (1:1) oder 10 ml 0,6 M Perchlorsäure: Methanol (1) homogenisiert : 1) unter Verwendung eines Ultra Turrax Homogenisators 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Dieser Vorgang wurde mit dem Rückstand zweimal wiederholt und die gesammelten Überstände wurden wie unten erwähnt gemischt und mittels HPLC analysiert.

2.2. RP-HPLC-Analyse von Pflanzenextrakten

Die Analyse von H. perforatum-Extrakten wurde durch RP-HPLC mit UV-Diodenarray und Fluoreszenzdetektion unter Verwendung einer HPLC 1050 (Agilent) in Verbindung mit einem 1100-Diodenarray-Detektor (DAD) (Agilent) und einem 1046A-Fluoreszenzdetektor durchgeführt. Ein 150 3.9 mm Identifikation., 4 µm, Nova-pak C18 Säule (Waters) zur Trennung verwendet. Chromatographische Bedingungen waren 50 mM Ammoniumphosphatpuffer (pH 3) (Puffer A) und 20% A in Acetonitril (Puffer B). Der Gradient wurde von 0% (100% A) auf 32% B in 8 min und 100% B bei 10 min programmiert. Die Flussrate betrug 1 ml/min, die Säulentemperatur 40°C und das Injektionsvolumen 20 µL. Der Nachweis von Hypericinen erfolgte durch Absorption bei 590 nm und Fluoreszenz bei 236 nm zur Anregung und 592 nm zur Emission. Die Konzentration von Hypericin wurde aus einer Kalibrierungskurve der Reaktion (Absorption bei 590 nm) gegenüber der Konzentration mit Lösungen bestimmt, die im Labor aus Hypericinstandard hergestellt wurden. Der gleiche Ansprechfaktor wurde auf Pseudohypericin, Protohypericin und Protopseudohypericin angewendet. Flavonoide und Flavonoidglykoside wurden bei 265 nm und 355 nm analysiert und die Konzentration von Quercetin wurde bei 355 nm aus einer Kalibrierungskurve von Reaktion gegen Konzentration bestimmt. Die HPLC-Fraktion entsprechend Flavonoiden und Flavonoidglykosiden (7 bis 11 min) wurde durch aufeinanderfolgende Injektionen von H. perforatum-Extrakt (Kräuter) gesammelt und nach Eindampfen im Vakuum in 30%igem Methanol gelöst und zur MAO-A-Hemmung eingesetzt. Die Phloroglucinole (Hyperforin, Adhyperforin, Hyperfirin und Adhyperfirin) wurden bei 280 nm unter Verwendung derselben Säule (Nova-pak C18) und Bedingungen, jedoch unter isokratischer Elution mit 20% 50 mM Ammoniumphosphatpuffer, pH 3, und 80% Acetonitril analysiert. Die Konzentration dieser Verbindungen wurde aus einer Eichkurve des Hyperforin-Standards bestimmt. Die Analyse von β-Carbolinalkaloiden in P. harmala und L. meyenii wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.

2.3. Identifizierung durch HPLC-ESI-Massenspektrometrie

Die Identifizierung von Verbindungen in H. perforatum-Extrakten erfolgte durch HPLC-MS (Elektrospray-Negativ-Ionen-Modus) unter Verwendung eines HPLC-DAD der Serie 1200, gekoppelt an ein 6110 Quadrupol-MS (Agilent). Die chromatographische Trennung wurde an einer 150 2,1 mm i.d. Zorbax SB-C18 (5 µm) Säule (Agilent Technologies) durchgeführt. Die chromatographischen Bedingungen waren Eluent A: Ameisensäure (0,1%); B: Ameisensäure (0,1%) in Acetonitril; Gradient: 0% bis 70% B in 8 min und 100% B bei 10 min, Flussrate: 0,3 mL/min;: 40 ° C; Massenbereich: 50-700 u und Konusspannung: 150 V. Zur Identifizierung von Phloroglucinolen (z. B. Hyperforin) erfolgte die Trennung mit einem Nova-Pak C18 (4 µm) Säule mit den gleichen Eluenten und isokratischer Elution (Eluent A, 20% und Eluent B, 80%) bei einer Flussrate von 0,7 ml/min und Massenspektren in negativer und positiver Ionisation aufgezeichnet. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte anhand von Massenspektren, UV-Vis-Spektren (DAD) chromatographischer Peaks und Koelution mit Standards. β-Carboline in P. harmala und L. meyenii wurden wie zuvor beschrieben identifiziert.

2.4. Monoaminoxidase (MAO-A) -Inhibitionstests

MAO-Assays wurden wie anderswo durchgeführt. Kurz wurden MAO-A-haltige Membranproteinfraktionen (BD-Gentest) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt. Ein 0,2 ml Reaktionsgemisch enthaltend 0,01 mg/ml Protein und 0.25 mM Kynuramin in 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,4) wurden 40 min bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 N NaOH (75 µL), gefolgt von der Zugabe von 70% HClO4 (25 µL) gestoppt und die Probe 10 min lang zentrifugiert (10000). Der Überstand (20 µL) wurde in die HPLC injiziert und das während der enzymatischen Reaktion gebildete Desaminierungsprodukt von Kynuramin (d. h. 4-Hydroxychinolin) durch RP-HPLC-Diodenarray-Detektion bei 320 nm bestimmt. Eine Antwortkurve von Fläche gegen Konzentration wurde konstruiert, um die Konzentration von 4-Hydroxychinolin zu berechnen. Zur Durchführung von Assays der MAO-Hemmung wurden zweckmäßigerweise Aliquots von Extrakten aus Pflanzen oder handelsüblichen Zubereitungen oder stattdessen reine Verbindungen verdünnt und zu Reaktionsgemischen enthaltend Kynuramin (0,25 mM) und MAO-A (0,01 mg/ml Protein) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gegeben, wobei die enzymatische Reaktion und Analyse wie oben durchgeführt wurde, und mit den entsprechenden lösungsmittelhaltigen Kontrollen verglichen. Der Standard-Inhibitor Clorgylin wurde als Positivkontrolle zur Hemmung verwendet (>90% Hemmung bei 2,5 µM). Inkubationen wurden mindestens doppelt aus verschiedenen Experimenten durchgeführt und die IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism 4.0 berechnet.

2.5. Bestimmung der antioxidativen Aktivität im Zusammenhang mit Monoaminoxidase (MAO) -Hemmung

Assays (0,2 ml) von Reaktionsgemischen in 70 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,025 mg / ml MAO-A-Protein und 0,25 mm Kynuramin, wurden bei 37 ° C für 40 min in Abwesenheit (Kontroll-Assays) oder in Gegenwart von Pflanzenextrakten inkubiert. MAO-Assays wurden auch in Gegenwart von Clorgylin (25 µM), einem klassischen Inhibitor von MAO-A (positive Kontrolle der Hemmung), oder Katalase-Enzym (100 µg / ml) durchgeführt. Nach der Inkubationszeit wurde das Reaktionsgemisch mit Aktivkohle (3,5 mg) versetzt, gemischt und filtriert (0,45 µm). Die Lösung wurde mit 20 µL 10 mM Tetramethylbenzidin (TMB) in 40% DMSO und 20 µL Meerrettichperoxidase (HRP) Typ II (1 mg/ml) versetzt, 5 min gehalten und mit 0,3 ml 0,5 M H2SO4-Lösung versetzt. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen, um TMB-Diimin zu bestimmen, ein gelbes Produkt, das aus der Oxidation von TMB durch HRP und dem H2O2 resultiert, das bei der durch MAO katalysierten oxidativen Desaminierung erzeugt wird. Die Oxidation von TMB in Gegenwart von Inhibitoren von MAO wurde mit den entsprechenden Kontrollen ohne Inhibitoren verglichen und entsprechende Rohlinge zeigten keine Interferenzen.

3. Ergebnisse und Diskussion

Kommerzielle Präparate von H. perforatum hemmten humanes MAO-A mit ähnlicher Potenz: IC50-Werte von 142,3 ± 30.6 µg/ml (pflanzliche Zubereitung), 193 ± 61 µg/ml (Kapseln) und 173 ± 29 µg/ml (Tabletten) (Abbildung 1(a)). In Bezug auf Pflanzen zeigten H. perforatum-Extrakte aus Blüten die höchste Hemmung (IC50 von 63,6 ± 9,4 µg / ml), gefolgt von oberirdischen Stängeln und Blättern (IC50 143,6 ± 16,5 µg / ml) und die niedrigste in Wurzelextrakten (Abbildung 1 (b)). Extrakte aus den oberirdischen Teilen von H. perforatum wurden mittels HPLC-DAD-ESI (Electrospray-negative Ionisation) analysiert. Sie zeigten das Vorhandensein von zwei Hauptnaphthodianthronen, die als Pseudohypericin und Hypericin identifiziert wurden (Abbildung 2 (a) und Tabelle 1). Blütenextrakte hatten zwei zusätzliche Verbindungen, die als Protopseudohypericin und Protohypericin identifiziert wurden. Phenole und Flavonoide waren reich an H. perforatum-Extrakten (Abbildung 2 (b)). Chlorogensäure und die Quercetinglykoside Rutin, Hyperosid, Isoquercitrin, Miquelianin, Acetylhyperosid und Quercitrin sowie freies Quercetin und Biapigenin wurden durch HPLC-DAD (ESI negative Ionisation) und DAD (Tabelle 1) identifiziert. Andererseits enthielten Blütenextrakte vier Phloroglucinole (Abbildung 2 (c)), die durch HPLC-DAD-MS (ESI negative und positive Ionisation) und DAD als Hyperforin, Adhyperforin, Hyperfirin und Adhyperfirin identifiziert wurden (Tabelle 1). Das Vorhandensein dieser Verbindungen (Abbildung 3) in der Pflanze stimmt mit anderen Ergebnissen überein . Der Gehalt der Hauptkomponenten wurde mittels HPLC bestimmt (Tabelle 2). Die Konzentration von Pseudohypericin war höher als die von Hypericin, während Protopseudohypericin und Protohypericin geringfügige Verbindungen waren (0,4 µg / mg Protopseudohypericin und 0.17 µg/mg Protohypericin wurden in Blüten nachgewiesen). In der Pflanze wurde der höchste Gehalt an Hypericinen in Blüten mit signifikant niedrigen Gehalten in Stängeln und Abwesenheit in Wurzeln gefunden. Hyperforin war in Blüten sehr häufig (27,2 µg / mg), während die Konzentration in kommerziellen Präparaten zwischen 0,36 und 2,4 µg / mg lag. In Blüten traten auch Adhyperforin (1,4 ± 0,07 µg / mg), Hyperfirin (4,2 ± 0,02 µg / mg) und Adhyperfirin (0,46 ± 0,02 µg / mg) auf. Flavonoide waren reich an H. perforatum und die meisten von ihnen waren Quercetin-Glykoside (Abbildung 2 (b)), deren Anwesenheit in Blüten signifikant höher war als in anderen Teilen der Pflanze. Der Gehalt an freiem Quercetin in Blüten betrug 2,0 µg/mg, während in handelsüblichen Präparaten ein Gehalt von 6,7 µg/mg bestimmt wurde.

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Abbildung 1

Hemmung der humanen Monoaminoxidase-A (MAO-A) durch Extrakte handelsüblicher Zubereitungen von H. perforatum (a) (Kapseln, Kapseln; Tabletten, ▲; kräuter, ▼) und Extrakte aus verschiedenen Pflanzenteilen (b) (Blüten, ∆; obere Stängel, ◊; Hauptstängel (zentral), ×; Wurzeln, ○). Signifikante Unterschiede () zwischen Extrakten in einer ausgewählten Konzentration sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

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Figure 2

HPLC chromatograms of extracts from H. perforatum flowers. (a) Detection of hypericins at 590 nm. 1: protopseudohypericin; 2: pseudohypericin; 3: protohypericin; and 4: hypericin. (b) Detection of phenols and flavonoids at 265 nm. 1: chlorogenic acid; 2: rutin; 3: hyperoside; 4: Isoquercitrin; 5: Miquelianin; 6: Acetylhyperosid; 7: Quercitrin; 8: Quercetin; und 9: Biapigenin. (c) Nachweis von Phloroglucinolen bei 280 nm. 1: Hyperfirin, 2: Adhyperfirin; 3: Hyperforin; und 4: Adhyperforin.

Abbildung 3

Strukturen von Verbindungen, die in H. perforatum identifiziert wurden: Hypericine, Quercetin und Quercetinflavonoide und Phloroglucinole (Hyperforin, Adhyperforin, Hyperfirin und Adhyperfirin).

Die Hemmung von MAO-A durch H. perforatum Extrakte zeigt das Auftreten von Inhibitoren. Hypericine, Hyperforin und Flavonoide tragen möglicherweise zu dieser Hemmung bei und wurden als Inhibitoren bewertet (Abbildung 4). Hypericin hemmte MAO-A (IC50 von 35,5 ± 2,1 µM oder 17,9 µg / ml) (Abbildung 4 (a)). Aus der Konzentration in Tabelle 2 geht hervor, dass Hypericin einen schwachen Beitrag zur MAO-Hemmung in H. perforatum-Extrakten leistet. Tatsächlich betrug der berechnete Gehalt an Hypericin bei IC50-Wert in Assays von Blütenextrakt (d. H. 63,6 µg / ml) 0,1 µg / ml, was im Vergleich zu IC50 von Hypericin (17,9 µg / ml) niedrig ist. Hyperforin hemmte MAO-A nicht (Abbildung 4(b)). Quercetin hemmte menschliches MAO-A (Abbildung 4(b)) mit einem IC50-Wert von 11,1 ± 0,8 µM (d. h. 3,36 µg / ml). Dann war Quercetin ein besserer Inhibitor als Hypericin, obwohl seine Wirksamkeit immer noch gering war, um die Hemmung der Extrakte zu erklären. Somit betrug der berechnete Gehalt an Quercetin bei IC50 in Assays von Blütenextrakt 0,13 µg / ml, was niedriger ist als der IC50 von Quercetin (3,4 µg / ml). Wenn die Fraktion, die Quercetinglykosiden und Flavonoiden entspricht (7-11 min, Abbildung 2 (b)), durch RP-HPLC gesammelt wurde, hemmte sie MAO-A (90% ige Hemmung bei 700 µg / ml Extrakt), was auf einen Beitrag dieser Verbindungen zur MAO-Hemmung in H. perforatum hinweist, wahrscheinlich durch additive Effekte. Dann könnte die Hemmung von MAO-A durch Komponenten wie Quercetin und verwandte Flavonoide (d. H. Quercetinglykoside) entstehen, die in der Pflanze reichlich vorhanden sind. Darüber hinaus könnten kleinere Verbindungen, die hier nicht identifiziert wurden, ebenfalls zur MAO-Hemmung beitragen, da die Hauptverbindungen in Tabelle 2 die gesamte Hemmung nicht erklären.

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Abbildung 4

Hemmung der humanen Monoaminoxidase-A (MAO-A) durch aktive Komponenten von H. perforatum: Hypericin (a) und Quercetin (■) und Hyperforin (▲) (b).

Extrakte aus P. harmala-Samen hemmten das humane MAO-A stark (Abbildung 5(a)) und ergaben einen IC50-Wert von 49,9 ± 5,6 µg/ l. Die chromatographische Analyse zeigte, dass die Hemmung auf das Vorhandensein der β-Carbolinalkaloide Harmalin und Harmin zurückzuführen war, die durch HPLC-DAD-MS identifiziert wurden (Abbildung 5 (c)). Der Gehalt dieser Alkaloide in Samen betrug 48,5 mg/g für Harmalin und 40,0 mg/g für Harmin (d.h. 2,4 ng/ml bzw. 2,0 ng/ml., in Assays am IC50). Daher war die Hemmkraft von MAO-A durch P. harmala-Samen 1274-mal stärker als die von H. perforatum-Blüten. Wie in Abbildung 5(b) gezeigt, hemmten Lepidium meyenii-Wurzelextrakte das humane MAO-A. L. meyenii (Maca) ist eine beliebte Pflanze aus dem Andenhochland, deren Wurzeln zunehmend für ihre ernährungsphysiologischen und medizinischen Eigenschaften als Energiequelle und zur Verbesserung der Stimmung und sexuellen Leistungsfähigkeit verwendet werden . Frühere Berichte haben gezeigt, dass sie Alkaloide enthalten, einschließlich β-Carboline, die MAO hemmen könnten. Die Analyse von Extrakten auf β-Carbolinalkaloide ergab 25 µg/g (Maca-Pulver) und 11,7 µg/g (Kapseln) 1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carbolin-3-carbonsäure als Hauptverbindung. Dieses spezifische β-Carbolin ist kein Inhibitor von MAO-A.

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Abbildung 5

Hemmung der humanen Monoaminoxidase-A (MAO-A) durch P. harmala Samen (a) und L. meyenii Wurzel (maca) Extrakte (b) (Kapseln, Kapseln und Pulver, ■). (c) HPLC-Chromatogramm von P. harmala-Samenextrakt, das den menschlichen MAO-A.-Absorptionsnachweis bei 254 nm stark inhibierte. Identifizierte Verbindungen sind Harmalin (m/z bei 215 (M + H)+, bei 375 nm) und Harmin (m/z bei 213 (M + H)+, bei 245 und 322 nm).

MAO erzeugt Wasserstoffperoxid (H2O2), das an oxidativen Zellschäden und pathologischen Zuständen beteiligt ist . Dann kann die Hemmung von MAO zu spezifischen antioxidativen Wirkungen führen . Um die antioxidative Aktivität im Zusammenhang mit der MAO-Hemmung zu untersuchen, wurden in dieser Studie Experimente durchgeführt, die die Aktivität von MAO-A mit der Oxidation von Tetramethylbenzidin (TMB) durch Meerrettichperoxidase (HRP) und dem H2O2 in Verbindung brachten, das während der oxidativen Desaminierung erzeugt wurde katalysiert durch MAO (Abbildung 6). H. perforatum- und P. harmala-Extrakte, die MAO-A hemmten, wie oben gezeigt, verringerten die Oxidation von TMB stark. Im Gegensatz dazu hatten L. meyenii-Wurzelextrakte (Maca), die MAO nicht hemmten, in diesem Test eine geringe antioxidative Aktivität. Clorgyline, das ein starker Hemmstoff von MAO-A ist, verringerte in hohem Grade die Oxidation von TMB, wenn es als Steuerung verwendet wurde. Das gleiche geschah mit der Anwesenheit von Katalase in den Medien, die H2O2 entfernt, das durch MAO-A erzeugt wird. Daher weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass H. perforatum- und P. harmala-Extrakte spezifische antioxidative Wirkungen zeigten, die mit einer geringeren Produktion von H2O2 durch Hemmung von MAO verbunden waren.

Abbildung 6

Antioxidative Aktivität im Zusammenhang mit MAO-Hemmung in Assays Kopplungsaktivität von MAO-A mit der anschließenden Oxidation von Tetramethylbenzidin (TMB) in Gegenwart H2O2 erzeugt bei der Reaktion von MAO und Meerrettichperoxidase (HRP). Die Grafik zeigt die Oxidation von TMB zu Diimin (Absorption bei 450 nm) in Kontrolltests (100%) und in Gegenwart von H. perforatum (Kräuter- und Blütenextrakte, 800 µg / ml), P. harmala Samenextrakte (0,8 µg / ml), L. meyenii Wurzel (Maca) Extrakte (800 µg / ml), Clorgylin (ein Standard-Inhibitor von MAO-A) (25 µm) und Katalase (100 µg / ml). unterschiede () im Vergleich zu Kontrollen.

H. perforatum verbessert Stimmungsstörungen und Depressionen . Wie hier gezeigt, enthält es Verbindungen wie Hyperforin, Hypericine und Flavonoide, die für antidepressive Wirkungen verantwortlich sind (Abbildung 2 und Tabelle 2). Der spezifische Mechanismus der antidepressiven Wirkung ist jedoch nicht vollständig verstanden. Der am meisten akzeptierte Mechanismus ist die Hemmung der Monoamin-Wiederaufnahme . Einige Studien deuten jedoch auf eine Kombination von Mechanismen und synergistischen Effekten hin . P. harmala übt zahlreiche biologische und pharmakologische Wirkungen aus. Ihre Samen werden aufgrund ihrer psychoaktiven und neuroaktiven Wirkung zunehmend für Erholungszwecke verwendet . Die Hemmung von menschlichem MAO-A ist ein etablierter Mechanismus für die antidepressive Wirkung . Sowohl irreversible als auch reversible Inhibitoren von MAO-A (z. B. Phenelzin und Moclobemid) werden erfolgreich als Antidepressiva eingesetzt. In dieser Studie hemmten H. perforatum-Extrakte das menschliche MAO-A. Diese Hemmung war jedoch moderat. Es war mehr als tausendmal niedriger als das von P. harmala-Samenextrakten. Sacher et al. haben berichtet, dass die Belegung von MAO-A-Stellen in das menschliche Gehirn, die durch PET-Bildgebung mit 11C-Harmin-Bindung (d. H. das gleiche β-Carbolin, das für die MAO-Hemmung in P. harmala verantwortlich ist) bestimmt wurde, für einen reversiblen MAO-Inhibitor wie Moclobemid hoch war, aber niedrig für H. perforatum-Extrakt (Johanniskraut) . Dies bedeutet, dass die Inhibitoren von MAO-A in H. perforatum im Gegensatz zum β-Carbolin-Harmin nicht effizient an aktive Stellen von MAO-A im Gehirn binden. Die Inhibitoren von MAO-A in H. perforatum sind Flavonoide wie Quercetin und ihre Glykoside, und die Spiegel dieser Verbindungen, die das Gehirn erreichen, reichen möglicherweise nicht aus, um die Stellen von MAO-A im Gehirn zu besetzen und das Enzym zu hemmen . Im Gegensatz dazu sind die Inhibitoren von P. harmala β-Carbolinalkaloide einschließlich Harmin und Harmalin, die eine sehr gute Gehirnpenetration aufweisen, mit hoher Affinität an MAO-Stellen binden und antidepressive Wirkungen zeigen . Daher konnte sich P. harmala durch MAO-Hemmung antidepressive Wirkungen leisten. In diesem Zusammenhang könnte es von Interesse sein, die antidepressiven Wirkungen von H zu untersuchen. perforatum und P. harmala allein und in Kombination, da sie unterschiedliche Wirkmechanismen haben.

Die Hemmung von MAO-A durch H. perforatum- und P. harmala-Extrakte kann zu anderen biologischen Wirkungen dieser Pflanzen wie antioxidativen Wirkungen und pharmakologischen Nebenwirkungen beitragen. Extrakte dieser Pflanzen üben neuroprotektive und entzündungshemmende Wirkungen aus, die mit antioxidativer Aktivität in Verbindung gebracht wurden . In dieser Hinsicht haben die Ergebnisse dieser Arbeit unter Verwendung eines neuen Verfahrens gezeigt, dass H. perforatum und P. harmala-Extrakte zeigen antioxidative Aktivität im Zusammenhang mit der Hemmung von MAO (geringere Produktion von H2O2). Auf der anderen Seite ist eine der Hauptbeschränkungen für die Verwendung dieser Pflanzen ihr Potenzial, unerwünschte Wechselwirkungen mit anderen Kräutern, Lebensmitteln und Medikamenten zu erzeugen . Die Hemmung von MAO-A kann unter bestimmten Umständen Nebenwirkungen auslösen.

4. Schlussfolgerungen

Extrakte aus H. perforatum hemmten menschliches MAO-A, und Extrakte aus Blüten waren die stärksten Inhibitoren. Sie wurden mittels HPLC-DAD-MS untersucht und enthielten Pseudohypericin, Hypericin, Hyperforin, Adhyperforin, Hyperfirin und Flavonoide. Der höchste Gehalt dieser Verbindungen erschien in Blüten. Hypericin war ein schwacher Inhibitor von MAO-A; Hyperforin hemmte das Enzym nicht und Quercetin war ein mäßiger Inhibitor. Die Fraktion der Quercetinglykoside und Flavonoide trug zur MAO-Hemmung bei. P. harmala-Samenextrakte hemmten MAO-A stark und seine Hemmkraft war aufgrund seines Gehalts an Harmalin- und Harminalkaloiden mehr als tausendmal höher als H. perforatum-Extrakte. L. die Hemmung von MAO-A erklärt möglicherweise nicht die gesamten ZNS-Effekte, die H. perforatum zugeschrieben werden, aber es wird erwartet, dass es zu diesen Wirkungen bei P. harmala beiträgt. Diese Pflanzen üben antioxidative Wirkungen aus. Durch die Verwendung einer neuen Methode haben diese Arbeiten gezeigt, dass P. harmala- und H. perforatum-Extrakte eine antioxidative Aktivität aufweisen, die mit der Hemmung von MAO verbunden ist.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagung

Die Autoren danken MINECO-FEDER (SAF2015-66690-R und SAF2015-68580-C2-R) und CSIC (Spanien) (Projekt 200470E658) für die Unterstützung dieser Arbeit. Die Autoren danken auch Marta Aguilar Preiss für die technische Unterstützung und Dr. V. Arán für die Unterstützung bei der Identifizierung und Auswahl der Pflanzen.