Hochwertige Sequenzierungsdaten sind ein wichtiger Teil, um sicherzustellen, dass Ihre Daten zuverlässig und replizierbar sind. Für RNA-seq-Daten bedeutet dies die Verwendung von RNA mit einer hohen RIN (RNA Integrity Number), einer 10-Punkte–Skala von 1 bis 10, die Forschern eine standardisierte Zahl zur Verfügung stellt, die die Qualität ihrer RNA angibt und individuelle Verzerrungen und Interpretationen aus dem Prozess entfernt.
Die RIN ist eine signifikante Verbesserung gegenüber der Art und Weise, wie die RNA-Integrität zuvor berechnet wurde: das 28S- und 18S-Verhältnis. Da 28S ungefähr 5 kb und 18S ungefähr 2 kb beträgt, beträgt das ideale Verhältnis 28S: 18S 2,7: 1 – der Benchmark wird jedoch als ungefähr 2: 1 angesehen. Diese Messung beruht jedoch auf der Annahme, dass die Qualität von rRNA (einem sehr stabilen Molekül) die mRNA-Qualität linear widerspiegelt, die tatsächlich viel weniger stabil ist und einen höheren Umsatz aufweist .
Abbildung 1: RNA-Spuren von RNA-Proben mit unterschiedlichen RIN-Werten. Beachten Sie den Unterschied zwischen Proben hoher und niedriger Qualität.
Glücklicherweise hat Agilent Technologies eine bessere Methode entwickelt: den RIN-Wert. Agilent hat einen ausgeklügelten Algorithmus entwickelt, der den RIN-Wert berechnet, eine Messung, die eine erhebliche Verbesserung gegenüber dem Verhältnis 28S: 18S darstellt. RIN ist insofern eine Verbesserung, als es die Gesamtheit der RNA-Probe berücksichtigt, nicht nur die rRNA-Messungen, wie Sie in Abbildung 1 sehen können
Die Bedeutung der RNA-Integrität bei der Bestimmung der Qualität der Genexpression wurde von Chen et al. im Jahr 2014 durch Vergleich von RNA–Proben mit 4 verschiedenen RIN-Nummern (von 4,5 – 9,4) und 3 verschiedenen Bibliothekspräparationsmethoden (Poly-A ausgewählt, rRNA-abgereichert und Gesamt-RNA) für insgesamt 12 Proben. Sie berechneten dann den Korrelationskoeffizienten der Genexpression zwischen der hochwertigsten RNA und den stärker degradierten Proben zwischen den Präparationsmethoden der Bibliothek.
Abbildung 2: Nur poly-A-ausgewählte RNA-Bibliothekspräparate weisen eine Abnahme der Datenqualität mit einer Abnahme des RIN-Wertes auf.
Faszinierend war die einzige Bibliotheksvorbereitungsmethode, die eine signifikante Abnahme der Korrelation zwischen hochwertiger und minderwertiger RNA zeigte, die Poly-A-ausgewählte Bibliotheksvorbereitungsmethode. Die beiden anderen Bibliotheksaufbereitungsverfahren wiesen auch bei niedrigen RINs noch Korrelationskoeffizienten von größer 0,95 auf (siehe Abbildung 2)!
Chen et al. theoretisieren Sie, dass der Grund dafür ist, dass degradierte Samples, die Poly-A ausgewählt sind, zu einer zunehmend 3’voreingenommenen Bibliotheksvorbereitung führen und dass Sie daher wertvolle Lesevorgänge aus Ihren Daten verlieren. Da die anderen Methoden entweder keine Behandlung oder rRNA-Entfernung beinhalten (im Gegensatz zur Selektion), wird die Gesamtprobe erheblich weniger verzerrt sein.
Auch wenn es den Anschein hat, als leide nur die poly-A selected library preparation method unter einer niedrigen RIN, bevorzugen Anbieter dennoch, bei allen library preparation method mit relativ hochwertigen RNA-Proben zu arbeiten. Wenn Sie jedoch wichtige Proben haben, die von geringerer Qualität sind, kann es sich lohnen, Ihre Optionen direkt mit einem Anbieter zu besprechen – und wir bei Genohub helfen Ihnen gerne dabei, Ihre Diskussionen zu erleichtern! Bitte kontaktieren Sie uns hier, wenn Sie weitere Fragen zur Sequenzierung von Proben mit schlechter RIN haben.