Expresión mejorada del ARNm de PEPCK
La isoforma citosólica de PEPCK es un sitio primario de regulación de la gluconeogénesis hepática y renal (71). Sin embargo, esta actividad no está regulada por mecanismos alostéricos ni por modificaciones covalentes. En cambio, está regulado únicamente por mecanismos que determinan el nivel del ARNm de PEPCK y, por lo tanto, controlan el nivel de la proteína PEPCK. Esto se logra a través de cambios en la velocidad de síntesis o en la velocidad de degradación del mRNA de PEPCK. El gen PCK1 que codifica la PEPCK citosólica está compuesto por 10 exones y 9 intrones y tiene aproximadamente 6 kb de longitud (13). Codifica un solo ARNm de 2,6 kb que se traduce en una proteína que contiene 621 aminoácidos y tiene una masa de 69.300 Da. El nivel de mRNA de PEPCK en el riñón de rata aumenta rápidamente tras la aparición aguda de acidosis (80). El aumento se inicia dentro de 1 hora y alcanza un máximo dentro de 7 horas a un nivel que es seis veces mayor de lo normal. Los experimentos de trascripción (80) indicaron que los cambios en la tasa relativa de transcripción del gen PCK1 explican la inducción inicial del ARNm de PEPCK. Además, los cambios observados en los niveles de ARNm de PEPCK se correlacionaron estrechamente con datos anteriores que midieron los cambios en las tasas relativas de síntesis de proteínas de PEPCK en ratas normales y acidóticas (84). Sin embargo, el nivel seis veces inducido de mRNA de PEPCK se mantiene en ratas que se hacen crónicamente acidóticas a pesar de que la tasa relativa de transcripción disminuye gradualmente y las mesetas a un nivel que solo es dos veces mayor que el observado en ratas normales (81).
Varios segmentos del promotor de PEPCK, así como del promotor central (-460 a +73 pb) que contienen mutaciones de bloqueo específicas en elementos reguladores, se han analizado ampliamente en animales transgénicos para determinar su papel en el control de la expresión génica de PCK1 (72). El promotor del núcleo de tipo salvaje fusionado con el gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) contiene toda la información necesaria para garantizar una expresión y regulación hormonal adecuadas en el hígado. Se requirió un segmento más grande de 2,3 kb del promotor de PEPCK para impulsar la expresión del transgén en el tejido adiposo. Sin embargo, ambos constructos se expresaron en niveles bajos en el riñón. En contraste, un transgén CRC362 que contiene solo 362 pb del promotor, pero todos los exones e intrones descendentes del gen PCK1 de rata, se expresó a niveles normales en el riñón (40). Este transgén se diferenció del gen endógeno solo por la sustitución de un segmento del gen PCK1 de pollo en la porción del exón final que codifica el 3′-UTR del ARNm de PEPCK. Además, este último constructo exhibe una inducción renal específica significativa cuando los ratones transgénicos se hicieron acidóticos (20).
Las células LLC-PK1-F + exhiben una inducción sensible al pH del ARNm de PEPCK (64). Los intentos anteriores de identificar un elemento que responde al pH mediante la expresión transitoria de varias construcciones reporteras de PEPCK-cloranfenicol acetiltransferasa en células LLC-PK1-F+ produjeron resultados contradictorios (21, 77). Sin embargo, estos estudios establecieron claramente que la unión de HNF-1 al elemento P2 es esencial para la expresión basal de la PEPCK renal y que esta interacción proteína-ADN puede contribuir al aumento de la expresión durante la acidosis. Los constructos de luciferasa que contienen 490 o 2300 pb del promotor de PEPCK se activan fuertemente por cotransfección de células LLC-PK1-F + con la subunidad catalítica de la proteína quinasa A (112). Sin embargo, ninguno de los constructos muestra una mayor actividad cuando las células transfectadas se transfieren a un medio ácido (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q et al., datos no publicados, 1999). Esta observación y el hallazgo de que un transgén que contiene solo 362 pb del promotor junto con los exones e intrones aguas abajo es suficiente para recapitular la inducción con respuesta al pH (20) sugieren que el gen PEPCK puede contener un elemento aguas abajo que es esencial para el aumento de la transcripción con respuesta al pH. Otros experimentos han establecido que C / EBPß (112) y ATF-2 (44) se unen al elemento CRE-1 del gen PEPCK en el riñón.
Estudios previos también han demostrado que la semivida del ARNm de PEPCK aumenta en el hígado en respuesta al cAMP (76) y a los glucocorticoides (132). El aumento de la estabilidad también puede contribuir a la inducción sostenida del ARNm de PEPCK renal durante la acidosis crónica (81). Por lo tanto, la estabilización selectiva del ARNm también puede desempeñar un papel importante en la regulación fisiológica de la expresión génica de PEPCK. El sistema promotor sensible a la tetraciclina se utilizó para cuantificar la vida media de varios ARNm quiméricos de β-globina-PEPCK (ßG-PCK) en células LLC-PK1-F+ (67).
El mRNA ßG-PCK-1, que contiene todo el 3′-UTR del mRNA de PEPCK, se degradó con una vida media de 1,2 horas. El tratamiento con la RNasa H indicó que se producía una rápida deadenilación concomitante con la degradación del ARNm ßG-PCK-1. Estudios previos (108) indicaron que el PCK-7, un segmento de 50 nt en el extremo 3’del 3′-UTR, se une a una proteína no identificada que puede contribuir a la rápida descomposición del ARNm de PEPCK. Sin embargo, el ARNm quimérico ßG-PCK-7 tiene una vida media de 17 horas. La inclusión del segmento adyacente de PCK-6, una región rica en UA de 23 bp, produjo el ARNm ßG-PCK-6/7 que tiene una vida media de 3,6 horas. El mRNA ßG-PCK-3 que contiene la mitad 3’de 3′-UTR se degradó con la misma vida media. Sorprendentemente, el mRNA ßG-PCK-2, que contiene el extremo 5’del 3′-UTR, también se degradó rápidamente (t1/2 = 5,4 horas). Los análisis de cambio de gel de ARN establecieron que el AUF1 se une a los segmentos PCK-7, PCK-6 y PCK-2 con alta afinidad y especificidad. El análisis mutacional indica que AUF1 se une a una secuencia UUAU-UUUAU dentro de PCK – 6 y una estructura de bucle de tallo y región CU adyacente de PCK-7. Por lo tanto, el AUF1 se une a múltiples elementos desestabilizadores dentro del 3′ -UTR que participan en la rápida rotación del mRNA de PEPCK. Experimentos más recientes indican que el segmento PCK-7 también se une a ζ-cristalina/NADPH: quinona reductasa con alta afinidad y especificidad (Hajarnis y Curthoys, datos no publicados, 2006). Por lo tanto, el mismo mecanismo que explica la inducción más gradual de los ARNm de AG y GDH también puede contribuir al aumento sostenido de los niveles de ARNm de PEPCK durante la acidosis crónica.