Virus d’Epstein-Barr – (EBV-) Les Lignées Cellulaires Lymphoblastoïdes Immortalisées (LCL) Expriment un Niveau élevé de CD23 mais un faible CD27 pour Soutenir leur croissance

Résumé

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est l’un des types d’herpèsvirus humains les plus courants dans le monde. L’EBV est connu pour infecter plus de 95% des adultes dans le monde. Le virus infecte principalement les lymphocytes B et pourrait immortaliser et transformer les cellules en lignées cellulaires lymphoblastoïdes porteuses d’EBV (LCL). Des études limitées ont été axées sur la caractérisation de l’expression des marqueurs de surface des LCL immortalisées. Cette étude démontre la génération de 15 LCL à partir de seize patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) et d’un volontaire en bonne santé utilisant le VEB dérivé du ouistiti B95-8. Le taux de réussite de la génération de LCL était de 88,23%. Toutes les LCL CD19+ ont exprimé CD23 (16,94-58,9 %) et CD27 (15,74-80,89 %) à la surface de la cellule. Nos données ont démontré deux catégories distinctes de LCL (croissance rapide et lente) (p < 0,05) en fonction de leur temps de doublement. Les LCL à croissance lente ont montré un niveau de CD23 inférieur (35,28%) par rapport aux LCL à croissance rapide (42,39%). En revanche, les LCL à croissance lente ont montré un pourcentage plus élevé de CD27 seul et de CD23+ CD27+ en combinaison. Dans l’ensemble, ces résultats peuvent suggérer les corrélations de l’expression cellulaire de CD23 et de CD27 avec le taux de prolifération des LCL générées. L’augmentation de l’expression de CD23 peut jouer un rôle dans l’immortalisation de l’EBV des cellules B ainsi que dans la croissance et le maintien des LCL transformées par l’EBV, tandis que l’expression de CD27 pourrait avoir des effets inhibiteurs sur la prolifération des LCL. D’autres enquêtes sont justifiées à ces spéculations.

1. Introduction

Le virus d’Epstein-Barr (VEB) a infecté plus de 95 % des adultes dans le monde. L’EBV cible et infecte principalement les lymphocytes B, suivis des cellules épithéliales et, dans une moindre mesure, des lymphocytes T CD4. Les virions infectieux sont produits après la réplication lytique dans les cellules B et les cellules épithéliales. Après le cycle lytique, la latence EBV suit et persiste dans les cellules B infectées pour le reste de la vie de l’individu. Le VEB provoque principalement une mononucléose infectieuse et il est également étroitement associé à des tumeurs malignes lymphoïdes et épithéliales telles que le lymphome de Burkitt, le lymphome de Hodgkin, le carcinome du nasopharynx et le cancer gastrique.

L’EBV infecte les lymphocytes B et pourrait immortaliser les lymphocytes B et former des LCL en croissance à long terme qui expriment systématiquement les virus. Cette méthode a été utilisée en laboratoire pour immortaliser certaines cellules B dérivées du sang humain qui peuvent ensuite être utilisées comme modèle de culture pour diverses études, y compris le dépistage à grande échelle de la bibliothèque de médicaments, l’étude des vaccins et les études biologiques à haut débit. Parmi tous, l’EBV produit à partir de B95-8, une lignée cellulaire de ouistitis, semble être la source d’EBV la plus courante et la plus puissante pour l’immortalisation des lymphocytes B. Au cours des dernières décennies, les chercheurs se sont efforcés d’améliorer la méthode d’immortalisation et son efficacité. Récemment, il a été montré qu’avec une modification mineure, les LCL pouvaient être générées à partir d’un petit volume de sang périphérique aussi bas que 0,1 mL. Cette constatation est particulièrement utile dans des circonstances où le volume d’échantillon est limité.

Des études antérieures ont rapporté que les cellules immunitaires, en particulier les cellules B et leurs sous-ensembles, jouent un rôle central dans la pathogenèse de la PR. Malgré le succès de l’immortalisation EBV des cellules B, peu de choses ont été faites sur la caractérisation des LCL et sa comparaison avec les cellules B parentales. Dans cette étude, nous avons démontré que l’EBV pouvait immortaliser efficacement les cellules B du sang périphérique des patients atteints de PR et former des LCL. Nous avons ensuite examiné les niveaux d’expression de plusieurs marqueurs de sous-population de lymphocytes B, y compris CD23 et CD27, dans les deux LCL et leurs lymphocytes B parentaux. Ces sous-populations de lymphocytes B ont déjà été associées à la présentation clinique de patients atteints de PR. Par exemple, des cellules B élevées exprimant CD23 ont été détectées chez des patients atteints de PR et elles pourraient être bloquées par des anticorps monoclonaux. De même, une quantité accrue de cellules B de mémoire IGD CD27 + a également été facilement détectée chez les patients atteints de PR active. D’autre part, Hu et ses collègues ont démontré que les lymphocytes B CD27 + étaient en corrélation négative avec l’activité de la maladie de la PR et qu’ils étaient altérés chez les patients.

Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer le niveau d’expression de CD23 et / ou CD27 des cellules B des PBMC et des LCL dérivées de patients atteints de PR. Nous avons également étudié le niveau d’expression de CD23 et CD27 en ce qui concerne la croissance cellulaire des LCL.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Des échantillons de patients

5 ml de sang périphérique provenant de seize patients atteints de PR (tableau 1) ont été prélevés au Centre médical de Sunway, en Malaisie, en vertu d’un code d’approbation éthique de 011/2017 / ER. Les PBMC ont été isolés à l’aide de la méthode Ficoll-Paque (GE Healthcare). Brièvement, le sang recueilli dans un tube d’EDTA a été dilué 1 à 1 avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et déposé sur une solution de Ficoll-Paque dans un tube à centrifuger frais. Le tube a été centrifugé à 400 xg pendant 40 minutes à température ambiante avec une faible accélération et un « freinage ». La couche supérieure qui est le plasma a été recueillie et aliquotée avant stockage à -80°C. La couche de buffy contenant les PBMC a été recueillie à l’aide d’une pipette Pasteur de 3mL et transférée dans un tube centrifuge frais. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS suivi d’un milieu RPMI contenant 10% de Sérum Fœtal Bovin (FBS), avant d’être cryoconservées dans du DMSO à 10% et stockées dans un réservoir de stockage d’azote liquide. 5 ml de sang ont été donnés par un volontaire en bonne santé comme témoin. Les PBMC et le plasma ont été traités et stockés comme décrit ci-dessus. La date du diagnostic, le prélèvement sanguin, la cryoconservation des PBMC et l’immortalisation du VEB sont indiqués dans des documents supplémentaires (disponibles ici).

2.2. Test sanguin et Calcul de l’Activité de la maladie

2.3. L’immortalisation de l’EBV

Le surnageant d’EBV dérivé du ouistiti B95-8 était un cadeau aimable du Dr Alan Soo-Beng Khoo, Unité de pathologie moléculaire, Institut de Recherche Médicale (IMR), Malaisie. Les cellules B du sang périphérique du patient ont été immortalisées à l’aide du surnageant EBV concentré tel que décrit précédemment. Le tableau des Matériaux supplémentaires indique la date d’isolement et de cryoconservation des PBMC, l’établissement des LCL et la durée des PBMC cryoconservées stockées dans un réservoir de stockage d’azote liquide. Brièvement, une fiole de PBMC préalablement cryoconservée a été décongelée et le numéro de cellule a été déterminé. Les cellules ont été ajustées à 2 x 106/mL à l’aide d’un surnageant EBV fraîchement décongelé et incubées pendant une nuit à 37°C, 5% de CO2 dans un ballon T25 sur pied. Le lendemain, du milieu de transformation (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml de cyclosporine) a été ajouté dans le flacon. Les cellules infectées par l’EBV ont été observées au microscope pour rechercher des LCL transformées en rosette en grappes. Les LCL des passages 3 à 6 ont été utilisées pour l’analyse de cytométrie en flux et le test de prolifération cellulaire.

2.4. Une cytométrie en flux

A été réalisée sur un cytomètre en flux FACSCalibur (Becton Dickinson) à l’aide d’anticorps monoclonaux identifiant les antigènes de surface des lymphocytes T (CD3/PE, clone SK7), des lymphocytes B (CD19/BB515, HIB19) et des sous-ensembles de lymphocytes B (CD23/APC, clone EBV-CS5, et CD27/PE, clone L128). La solution de viabilité cellulaire 7AAD (VIA-PROBE) a été achetée pour déterminer la viabilité cellulaire. Tous les anticorps ont été achetés auprès de Becton Dickinson. Brièvement, les PBMC cryoconservés ont été décongelés et remis en suspension dans 50µL de BSA stain buffer (Becton Dickinson) et incubés à température ambiante dans l’obscurité avec des anticorps conjugués fluorochromes prédilutés pendant 30 minutes. Les PBMC ont ensuite été lavés deux fois avec du tampon de teinture BSA et remis en suspension dans 500µL de tampon BSA pour une analyse de cytométrie en flux. Les suspensions de PBMC témoins ont été préparées selon la même procédure. 20 000 cellules viables déterminées par le colorant de viabilité cellulaire ont été bloquées et collectées pour une analyse en trois couleurs sur des ensembles de CD3/CD19/CD23 et CD19/CD27/CD23. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel CellQuest Pro (Becton Dickinson).

2.5. Test de prolifération des LCL

Pour séparer les LCL en deux catégories (croissance rapide et croissance lente), le taux de prolifération cellulaire a été déterminé à l’aide du test de viabilité cellulaire Glo MT en temps réel (Promega), conformément aux instructions du fabricant. Il s’agit d’un test basé sur la luminescence non-lytique qui peut détecter la prolifération en temps réel de cellules vivantes en culture jusqu’à 72 heures. Brièvement, 10 000 cellules /puits ont été ensemencées sur une plaque blanche à fond plat de 96 puits (Greiner Bio-one) en trois exemplaires. Un mélange de réaction 2X a été préparé à partir du kit fourni et ajouté à chaque puits. Les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 1 heure avant que la mesure ne soit prise à différents moments (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, et 72 heures) à l’aide d’un lecteur de microplaques à luminescence (Tecan). Les unités de luminescence relative (UR) en fonction du temps ont été tracées pour montrer la courbe de croissance des LCL. Dans ce graphique, le numéro de cellule était représenté par les UR. À l’aide du RLU, le temps de doublement (temps nécessaire pour qu’un nombre de cellules double de valeur) de chaque catégorie de LCL a été calculé à l’aide d’un calculateur en ligne multipoint utilisé pour les tests de signification. Cet outil en ligne utilise la méthode des moindres carrés pour calculer le temps de doublement. Le taux de croissance (nombre de doublements qui se produisent par unité de temps) a ensuite été calculé à l’aide de la formule ci-dessous: La valeur moyenne du temps de doublement de toutes les LCL était de 54,69 heures. Par conséquent, cette valeur a été utilisée comme coupure et LCLs avec un temps de doublement supérieur à 54.69 heures ont été regroupées en LCL à croissance lente et vice versa pour les LCL à croissance rapide.

2.6. Analyse statistique

L’analyse par cytométrie en flux a été réalisée dans trois expériences indépendantes pour chaque catégorie de LCL, sauf indication contraire. Les données ont été exprimées en valeurs moyennes écarts types (std. dev). La signification a été déterminée à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney et Kruskal-Wallis H) dans lesquels les données sont considérées comme significatives lorsque p est inférieur à 0,05.

3. Résultats et discussion

3.1. Activité pathologique des sujets de l’étude

Le tableau 1 montre les données démographiques des seize patients atteints de PR et d’un individu en bonne santé et les résultats de leurs tests sanguins de marqueurs diagnostiques de PR couramment utilisés indiquant leurs activités pathologiques. Sur la base de l’indice DAS28-CRP de 16 patients atteints de PR, 3 de ces patients ont été classés comme activité élevée de la maladie, 8 comme activité modérée, 3 comme rémission et les deux autres comme statut inconnu en raison d’une collecte de données incomplète.

3.2. Des LCL

PBMC ont été prélevées sur les seize patients atteints de PR et un donneur sain (étiqueté C) (tableau 1) et cryoconservées. Des aliquotes de PBMC cryoconservées ont ensuite été utilisées pour l’infection par le VEB. Sur les dix-sept flacons, 15 LCL transformées en EBV (sauf 4E et 14A) ont été générées une semaine après l’infection, au cours de laquelle des amas de cellules visibles ont été vus des flacons. Visualisées au microscope, les LCL présentaient une morphologie typique des rosettes de différentes tailles, comme l’indiquent les flèches rouges (Figure 1). Le taux de réussite de la génération LCLs était de 88,23% (15 sur 17).

Figure 1

Examen microscopique de cellules B immortalisées par EBV dérivées de PBMC chez un patient atteint de PR 8A une semaine après l’infection. Ces cellules immortalisées sont annotées comme LCL-8A. Les flèches rouges montrent les LCL immortalisées en EBV en forme de rosette à des grossissements de 4x (panneau supérieur), 10x (panneau central) et 20x (panneau inférieur). Les barres d’échelle sont indiquées en jaune.

3.3. Calcul du taux de croissance et du temps de doublement des LCL générées

Nous avons ensuite déterminé le taux de croissance de chaque catégorie de LCL générée à l’aide d’un test de prolifération cellulaire basé sur la luminescence en temps réel. La figure 2 montre la courbe de croissance de chaque catégorie de LCL représentée par les unités de luminescence relative (UR). Le tableau 2 montre le temps de doublement calculé et le taux de croissance des LCL respectives à l’aide d’un calculateur en ligne. À partir du temps de doublement obtenu de chaque catégorie de LCL, nous divisons les LCL en deux catégories en utilisant 54.69 heures (valeur moyenne de toutes les LCL) comme valeur limite, ce qui a entraîné 10 LCL à croissance rapide et 5 LCL à croissance lente (tableaux 2 et 4) (p < 0,05).

Figure 2

Courbes de croissance des LCL. Les unités de luminescence relative représentent les signaux de viabilité des cellules à différents moments. Les lignes remplies représentent les LCL à croissance rapide tandis que les lignes pointillées représentent les LCL à croissance lente.

3.4. Expression des marqueurs de surface des LCL

PBMC et des LCL correspondantes ont été soumis à une analyse par cytométrie en flux pour déterminer leur expression des marqueurs de surface, y compris CD3, CD19, CD23 et CD27. CD3 et CD19 sont des marqueurs de surface pour les lymphocytes T et les lymphocytes B, respectivement. En utilisant les PBMC isolés du patient 8A et le LCL-8A correspondant comme exemples, la figure 3 montre comment les lymphocytes T CD3+ et les lymphocytes B CD19+ ont été profilés et fermés par cytométrie en flux. Le niveau d’expression a ensuite été présenté en pourcentage du nombre total de lymphocytes analysés, soit 20 000 cellules. Dans les PBMC des donneurs, 29,78 à 81,8% étaient des lymphocytes T tandis que 2,35 à 45,95% comprenaient des lymphocytes B. Après la transformation de l’EBV, les populations de lymphocytes T ont diminué à 0-0,27% tandis que les populations de lymphocytes B ont augmenté à 68,59-89,35%. Cela indique clairement le succès de l’immortalisation des lymphocytes B par EBV qui a repris la population de lymphocytes T. Les lymphocytes T CD3+ sont sénescés et seraient complètement lavés des LCL.

Figure 3

Profilage des marqueurs de surface des lymphocytes T (CD3) et des lymphocytes B (CD19) par cytométrie en flux. Le panneau supérieur montre l’analyse des PBMC isolés du patient 8A tandis que le panneau inférieur montre l’analyse des LCL correspondantes (LCL-8A). R1: cellules vivantes 7AAD; R2: lymphocytes fermés; R3: lymphocytes T fermés CD3 +; R4: lymphocytes B fermés CD19 +.

CD23 est un marqueur d’activation des cellules B tandis que CD27 est un marqueur pour les cellules B de la mémoire. Chez les patients atteints de PR, des taux élevés de lymphocytes B exprimant le CD23 ont déjà été rapportés comme étant en corrélation positive avec l’activité de la maladie, et ils pourraient potentiellement servir de cible thérapeutique. En revanche, les lymphocytes B CD27+ étaient en corrélation négative avec l’activité de la maladie et étaient altérés chez les patients atteints de PR. Dans la présente étude, nous n’avons pas pu différencier le modèle d’expression de CD23 et de CD27 dans les PBMC et les LCL (tableau 3). La figure 4 représente le déclenchement de CD19+, CD23+ et CD27+ à partir des PBMC isolés du patient 8A et du LCL-8A correspondant par cytométrie en flux. De toutes les LCL, alors que 68,59 à 89,35% étaient des CD19+ comme prévu, ils présentent une expression de CD23 (16,94 à 58,9%) et de CD27 (15,74 à 80,89%). Les cellules B coexprimant CD23 et CD27 étaient de 5,72 à 41,53% (tableau 3).

3.5. Corrélation de l’Activité de la maladie, du Niveau d’Expression des marqueurs de surface et de la prolifération des LCL

Une analyse statistique a été effectuée pour tester la corrélation entre l’activité de la maladie et les expressions des marqueurs de surface; cependant, aucune d’entre elles n’a montré d’importance. De même, l’activité de la maladie n’était pas corrélée avec le taux de croissance des LCL correspondantes.

À partir du temps de doublement de chaque catégorie de LCL, les valeurs moyennes des LCL à croissance rapide et lente ont été déterminées et soumises à une analyse statistique. Le tableau 4 montre une différence significative (p < 0.05) en termes de temps de doublement entre les deux catégories. De même, les valeurs moyennes des niveaux CD23, CD27 et CD23+CD27+ de la catégorie respective ont été déterminées. Les LCL à croissance rapide ont une expression plus élevée de CD23 (42,39%) que les LCL à croissance lente (35,28%). Cependant, cela n’est pas statistiquement significatif (tableau 4). Inversement, l’expression de CD27 et la coexpression de CD23/CD27 étaient plus faibles dans les LCL à croissance rapide (36,15 et 13,36 %, respectivement) que dans les LCL à croissance lente (51,57 % et 19,49 %, respectivement). Lorsqu’une analyse statistique est effectuée, seules les LCL à croissance rapide affichent une expression nettement inférieure de CD27, mais pas de CD23/CD27. D’autres études avec une plus grande taille d’échantillon sont nécessaires pour valider ces résultats.

L’expression élevée de CD23 peut être due à l’infection ou à la transformation du VEB. Il existe des preuves montrant que l’immortalisation des cellules B pourrait s’appuyer sur l’expression cellulaire de CD23. L’étude a montré que les lymphocytes B CD23 négatifs pouvaient être infectés par le VEB mais ne pouvaient pas être immortalisés à moins d’être complétés par des facteurs de croissance spécifiques. Une autre étude a montré que les lymphocytes B infectés par le VEB pouvaient se développer en deux sous-populations distinctes : CD58 + IL6- et CD58+ IL6+. La première sous-population de lymphocytes B a activement proliféré tandis que la seconde sous-population a cessé de proliférer. L’expression de CD23 pourrait également être induite par l’expression de l’antigène nucléaire EBV 2 (EBNA-2) suite à la transformation EBV des cellules B comme décrit précédemment dans une lignée cellulaire de lymphome de Burkitt (BL). En revanche, l’expression plus élevée de CD27 dans les LCL à croissance lente peut suggérer leurs effets inhibiteurs sur la prolifération des LCL.

4. Conclusions

Le CD23 pourrait jouer un rôle stimulant dans la transformation du VEB des cellules B et la croissance des LCL. Nos études ont montré que les LCL à croissance rapide présentaient une expression CD23 plus élevée et une expression CD27 et une expression CD23CD27 plus faibles. D’autres études avec une plus grande taille d’échantillon sont justifiées pour étudier en profondeur l’implication de l’expression du marqueur de surface sur le maintien de l’EBV et la croissance cellulaire.

Disponibilité des données

Les données utilisées pour étayer les résultats de cette étude sont incluses dans l’article.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Alan Soo-Beng Khoo de l’Unité de pathologie moléculaire de l’Institut de recherche médicale (IMR), Malaisie, pour sa générosité en nous fournissant l’EBV dérivé du ouistiti B95-8 pour notre travail d’immortalisation. Hooi-Yeen Yap est titulaire d’une maîtrise de l’Université Sunway grâce à une bourse de recherche. Cette recherche a été financée par la Bourse de recherche interne de l’Université Sunway 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), la Bourse de recherche sur le cancer du Conseil National du Cancer de Malaisie (MAKNA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) et les Fonds de recherche du Centre Médical Sunway (SRC/002/2017/ FR et SRC/003/2017/ FR).

Matériaux supplémentaires

Le tableau montre les cas étudiés avec la date du diagnostic, le prélèvement sanguin, la cryoconservation des PBMC, l’immortalisation du VEB et la durée des PBMC cryoconservées. (Documents supplémentaires)