határok a genetikában

Bevezetés

az infantilis neuroaxonális disztrófia (Inad) ismeretlen gyakoriságú autoszomális recesszív ritka neurodegeneratív betegség. A tünetek általában 6 hónapos és 3 éves kor között jelentkeznek. Ezt megelőzően a csecsemők normálisan fejlődnek. Az INAD első tünete lehet a normális fejlődési mérföldkövek elérésének lassulása vagy a fejlődési mérföldkövek regressziója (Ramanadham et al., 2015). A Trunk hypotonia, a strabismus és a nystagmus a betegség korai tünetei (Gregory et al., 2017). A betegség előrehaladása gyors, és előrehaladtával több megszerzett készség elveszik. Az izmok hamarosan hipotóniássá, később görcsössé válnak (Levi and Finazzi, 2014). Végül minden önkéntes izomkontroll elvész. Az izomgyengeség az etetés és a légzés nehézségeihez is vezethet. A nystagmus mellett néhány gyermek látásvesztést tapasztal. A kognitív funkciók fokozatosan elvesznek, és demencia alakul ki. Az élettartam általában 5-10 év (Gregory et al., 1993; Jardim et al., 2004; Macauley And Sands, 2009).

molekuláris patológia

az infantilis Neuroaxonális disztrófia a neurodegeneratív rendellenességek családjába tartozik, amely magában foglalja az atipikus késői neuroaxonális disztrófiát (ANAD) és a dystonia parkinsonizmus komplexet (DPC). Az INAD legtöbb esete homozigóta vagy összetett heterozigóta mutációkkal társul a PLA2G6 génben, amelyek befolyásolják fehérjetermékének katalitikus aktivitását (Engel et al., 2010). A PLA2G6 gén kalciumfüggetlen foszfolipáz A2 fehérjén (PLA2G6 vagy ipla2 65/88 kDa) keresztül kódol egy csoportot egy lipázzal és hét ankyrin ismétlődéstartalmú doménnel (Tang et al., 1997). A PLA2G6 hidrolizálja a foszfolipidek sn-2 Acil láncát, szabad zsírsavakat és lizofoszfolipideket hozva létre.

a mitokondriumok belső membránjában lévő foszfolipidek telítetlen zsírsavakban gazdagok az sn – 2 helyzetben, különösen a kardiolipinben (Seleznev et al., 2006). Ezek a telítetlen zsírsavak különösen érzékenyek a mitokondriumok által termelt bőséges reaktív oxigénfajokra (Murphy, 2009), ami peroxidált foszfolipideket eredményez a mitokondriumok belső membránjában. A PLA2G6 lokalizálódik a mitokondriumokban (Williams and Gottlieb, 2002; Liou et al., 2005) összhangban van a peroxidált zsírsavak hidrolízisének megnövekedett igényével a foszfolipidek SN-2 helyzetében, ami átalakult foszfolipidekhez vezet (Balsinde et al., 1995; Zhao et al., 2010). Ha a PLA2G6 hibás, a mitokondriumok belső membrán integritása megsérül. A PLA2G6 az axonra is lokalizálódik (Ong et al., 2005; Seleznev et al., 2006), ami a foszfolipid átalakítás iránti megnövekedett helyi igényt jelzi ott is. Az ilyen felhalmozódás megnyilvánulása az agyban egyedülálló a kulcsfontosságú agyterületeken, például a bazális ganglionokon, amelyek ugyanazon mögöttes molekuláris patogenezis különböző neveit eredményezték PLAG26 (Mehnaaz, 2016; Nassif et al., 2016).

a pla2g6 kiütéses egerek neuronjainak ultrastrukturális elemzése összhangban áll ezzel a molekuláris patológiával. Mitokondriumokat elágazó és tubuláris cristae-val, mitokondriumokat degenerált cristae-val, axonokat citoszkeleton összeomlással és részleges membránvesztést figyeltek meg az axon terminálokon (Beck et al., 2011). Mikroszkopikus szinten ezek a jellemzők axonális duzzanatokként és szferoid testekként jelennek meg a központi vagy perifériás idegrendszer pre-szinaptikus terminálisaiban (1.ábra).

1. ábra. Az infantilis neuroaxonális disztrófia (INAD) egy neurodegeneratív rendellenesség, amely a PLA2G6 gén mutációival kapcsolatos. A PLA2G6 különböző mutációi diszfunkcionális A2 foszfolipázhoz vezetnek, ami mitokondriális és axonális membránhibákhoz vezet. Ezek a hibák neuronális károsodást okoznak axonális duzzanatokként és a pre-szinaptikus szferoidok felhalmozódásaként. Enzimpótlás a funkciók helyreállításához, génpótlás vagy szerkesztés a hibás PLA2G6 kijavításához javasolt terápiás stratégiák.

molekuláris diagnosztika és ritka betegségben szenvedő betegek felhatalmazása

a specifikus klinikai, elektrofiziológiai és képalkotó funkcióktól eltekintve, a következő generációs szekvenálás elérhetősége előtt az inad megerősítésének diagnosztikai kritériumai voltak a központi vagy perifériás idegrendszer pre-szinaptikus terminálisaiban axonális duzzanatokat és szferoid testeket mutató bőrbiopsziák (Gregory et al., 2017; Iodice et al., 2017). Gyakran több biopsziára volt szükség a diagnózis megerősítéséhez. A családok általában sok évet vártak a diagnózisra. A gén-és genomszekvenálás költségeinek csökkenésével, a diagnosztizálatlan neurológiai betegségek diagnosztikai laboratóriumokkal történő célzott génpanel-tesztelésének elérhetőségével és az orvosok növekvő tudatosságával a genetikai diagnosztika elérhetőségével a családok gyorsabban kapják meg a diagnózist; néha az első tünet megjelenésétől számított egy éven belül. Ezekben a családokban a gyerekek még fiatalok, és a családok motiváltak arra, hogy a tudósokkal együttműködve megtalálják gyermekeik betegségének kezelését. A kutatási folyamat finanszírozása érdekében az INAD betegek szüleinek egy csoportja megalapította az INADcure Alapítványt. Az alapítvány jelentős forrásokat gyűjtött a kutatáshoz, és együttműködik a ritka genomikai Intézettel, hogy irányítsa őket a kutatási támogatások odaítélésében. Érdekes módon egy 2016-os genetikai elemzés 22 indiai családok INAD, ANAD, és DPC megállapította, hogy 10/22 család (45,45%) hiányzott mutációk a PLA2G6 gén kódoló régióban (Kapoor et al., 2016). A pla2g6 kódoló régiójában a káros mutációk azonosításának elmulasztása rávilágít arra, hogy a jövőbeni molekuláris diagnosztikai erőfeszítésekhez teljes génszekvenálásra lenne szükség a PLA2G6 gén intronikus és szabályozó régióinak mutációinak azonosításához INAD érintett betegeknél. Továbbá az olyan esetek, amikor a PLA2G6-hoz kapcsolódó mutációkat nem figyelték meg, arra utalnak, hogy a betegség oka a PLA2G-től eltérő gének mutációja lehet, amelyet meg kell vizsgálni.

lehetséges terápiák

egy olyan ritka betegség esetében, mint az inad, amely hibás enzimet tartalmaz, a legtöbb terápia enzimpótlás, génpótlás vagy génkorrekció. Ha az enzimhiányt recesszív genetikai hiba okozza, feltételezzük, hogy az enzimpótlás vagy kiegészítés kijavíthatja a problémát (Smith et al., 2012; Yu-Wai-Man, 2016). Azonban a kísérletek annak bizonyítására, hogy a megfelelő gént vagy enzimet biztosító terápiák megmentik az INAD fenotípust, még nem végeztek és teszteltek.

enzimpótló terápia (ERT)

mivel az inad-ban az agy az elsődleges szerv, az inad enzimpótló terápiájához nagy valószínűséggel az enzim agyba történő infúziója szükséges. 2017-ben a Biomarin megkapta az FDA jóváhagyását a tripeptidil-peptidáz 1 (cerliponáz alfa) kezelésére a Batten-betegség, a tripeptidil-peptidáz (TPP1) hiánya lizoszomális enzim (USA Food Drug Administration, 2017). Tripeptidil-peptidáz 1 (cerliponáz alfa; 59 kDa) az első ERT, amelyet közvetlenül az agy cerebrospinális folyadékába (CSF) adnak be. A CSF-be beadható egyéb ERT-gyógyszerek klinikai vizsgálatokban vannak (Jardim et al., 2004; Macauley And Sands, 2009).

a tripeptidil-peptidáz 1 (cerliponáz alfa) hatékonysága a Batten-betegségben szenvedő betegek járóképességén azt mutatja, hogy az agyat érintő betegségek enzimpótló terápiája elméletileg lehetséges. A helyettesítő enzim célzása az INAD mitokondriumaiba nagyobb kihívást jelent, mint a lizoszomális célzás, amely már hosszú ideje sikeres volt az IV ERT által, mint a Gaucher-kór esetében. Ezért még mindig sok, az INAD-ra jellemző biológiai kérdés van, amelyeket meg kell oldani:

• szükség van-e az INAD terápiájára olyan mechanizmusokra, amelyek esetleg pla2g6-ot szállíthatnak a sejtbe?

további probléma, hogy az enzimpótló kezelés megköveteli az intracerebroventricularis katéter kezdeti elhelyezését és gyakori infúziókat. A katéter elhelyezése érzéstelenítést igényel, az infúziók pedig érzéstelenítést igényelhetnek a betegek együttműködésétől függően. Az inad-ben szenvedő gyermekek gyermekneurológusainak és szüleinek aggodalmainak kezelése az anesztézia alkalmazásával kapcsolatban inad-betegeknél megfelelő információkkal további erőfeszítéseket igényel.

génterápia/Génpótlás

az emberi PLA2G gén körülbelül 70 kb, 17 exonnal és 2 Alternatív exonnal. A leghosszabb fehérje-kódoló transzkriptum azonban csak 3,3 kb, a fehérje kódoló szekvencia pedig alig több mint 2,4 kb, amelyet könnyen be lehet csomagolni egy vírusvektor rakományba. Először egy másik lizoszomális tárolási rendellenességet fedezünk fel a központi idegrendszerben, amelyek preklinikai adatokkal rendelkeznek, majd összehasonlíthatók az INAD-val. Az ERT preklinikai adatainak hiánya az INAD-ban jelentős ismerethiány a területen, ezért elengedhetetlen, hogy megfigyeljük a központi idegrendszeri rendellenességek egyéb preklinikai modelljeit, amelyek génterápiás vizsgálatokon mennek keresztül. Korábban egereken végzett preklinikai vizsgálat foglalkozott a lizoszomális tárolási rendellenesség GÉNTERÁPIÁJÁVAL IIIa típusú mukopoliszacharidózisok (MPS-IIIA) a szulfamidáz gén helyes változatának vírusvektorba csomagolásával (Sorrentino et al., 2013). A tanulmány kihasználta a vér-agy gát (BBB) növekvő megértését, amely aktívan szabályozza a nagy molekulák szállítását a vérből a központi idegrendszerbe egy transzcitózisnak nevezett folyamat révén (Pardridge, 2005b; Sorrentino and Fraldi, 2016).

a Transzcitózis magában foglalja a ligandumok endocitózisát a luminalis oldalon, ligandum-specifikus receptorok (pl. inzulinreceptor, transzferrin receptorés alacsony sűrűségű lipoprotein receptor stb.,) a kapilláris endotheliumon dúsítva (Pardridge, 2005a). Ezt követi az endocytosed rakomány mozgása az endothelium citoplazmán keresztül, végül exocitózis az abluminalis (agy) oldalon, így hatékonyan szállítja a rakományt a BBB-n keresztül (Pardridge, 2002). Az MPS-IIIA preklinikai vizsgálat egy kiméra szulfamidáz fehérjét gyártott, amely BBB-kötő domént tartalmazott az apolipoprotein B-ből, hogy megkönnyítse az endothelium felvételét, valamint az iduronát-2-szulfatáz szignálpeptidjét, hogy elősegítse a hatékony exocitózist a BBB abluminális oldala felé (Sorrentino et al., 2013). Egy kiméra szulfamidázt kódoló vírusvektor rakományt ezután a májat célzó 2/8-as szerotípusú adeno-asszociált vírusra (AAV) töltöttünk (Sorrentino and Fraldi, 2016). Így a máj belső gyárként szolgált, amely állandó kiméra-szulfamidáz-ellátást biztosított, ami az agy szulfamidáz aktivitásának 10-15% – os növekedését eredményezte még 7 hónappal a máj génterápiája után is. Az agyi szulfamidáz aktivitás szintjének növekedése az agy patológiájának és viselkedési eredményeinek számszerűsíthető javulásához vezetett az MPS-IIIA egérmodelljében (Sorrentino et al., 2013).

ha hasonló vizsgálatot végeznek az INAD-val kapcsolatban, az számos kritikus kérdésre válaszolna az inad terápia enzimpótlásával kapcsolatban. Alternatív megoldásként az aav9 alapú génterápiás termékek vaszkuláris vagy CSF-en belüli beadása közvetlenül megcélozhatja a központi idegrendszert (Bey et al., 2017; Roca et al., 2017). Azonban a többszörös mutációk, amelyek az INAD-betegeknél a PLAG26 génjükön vannak, egyedülálló kihívásokat jelentenek a génterápia számára. Bár a PLA2G6 gén mérete 2-3 kb nem jelenthet problémát a vírusvektorba történő beillesztésében, a pla2g6 korrekciójának szabályozási szövődményeit azonban nehéz megjósolni. A szabályozási szövődmények ellenőrizhetetlenné válnak, különösen akkor, ha a génterápia nem lokalizálható megfelelően a célszövetekben. Az enzimpótló terápia akkor is problémát jelenthet, ha egyes mutáns termékek domináns negatívnak bizonyulnak a vad típusú PLAG26-ra.

az INAD lehetséges terápiáinak legtöbb kihívása abból adódik, hogy rendkívül ritka betegségről van szó. Az a tény azonban, hogy az INAD ismert genetikai etiológiával rendelkezik, lehetőséget nyújt a lehetséges terápiákra. Ezenkívül az INAD sikeres terápiája Ritka Betegségek Gyógyszer státusát és minden védelmet kap, mivel az INAD ritka betegség. Így a fent említett kihívások ellenére a ritka betegségek gyógyszereinek státusza erős ösztönzést nyújt a ritka betegségek kutatóinak és a biotechnológiai iparnak, nem is beszélve arról, hogy a genetikai ok már ismert.

gén / bázis Szerkesztés

2017-től legalább 277 missense mutációt figyeltek meg az emberi PLA2G6 génben (Lek et al., 2016). A PLA2G6 mutációknak csak egy kis hányada tartalmazza a kereteltolódásokat, az indeleket, a nonszensz mutációkat és a splice helyek mutációit (Morgan et al., 2006). Így a gén korrekciója a célsejtpopulációban vagy a mutált DNS-bázisok korrekciója vonzó terápiás út. Az évek során számos eszközt fejlesztettek ki a génszerkesztéshez, és a CRISPR/Cas9-alapú genomszerkesztést úttörő technológiának tekintik egy 2018-ban tervezett klinikai vizsgálattal. Ezek a technológiák olyan DNS-kötő fehérjét használnak, amely a szálat is meghatározott módon hasíthatja, hogy helyet biztosítson egy új DNS-szekvencia beillesztéséhez vagy a káros DNS-bázis korrekciójához (LaFountaine et al., 2015). A CRISPR / Cas9 technológia már meghökkentő terápiás eredményeket hozott számos preklinikai betegségmodellben(pl.,) (Dai et al., 2016). Ezenkívül az emberi variáció növekvő megértése újabb kihívásokat jelent a génterápia számára, és az innovációt a génszerkesztés valódi személyre szabása felé irányítja (Lessard et al., 2017; Scott és Zhang, 2017). Az olyan új technológiák, mint a vSLENDR, az AAV vírus és a CRISPR/Cas9 által közvetített technológia a neuronok és más idegrendszeri sejtek hibás génjeinek helyettesítésére, a génszerkesztő technológiákat új határok felé tolják (Nishiyama et al., 2017).

következtetés

az infantilis Neuroaxonális dystrophia súlyos neurodegeneratív betegség, bizonyos morbiditással és mortalitással. Ez a ritka betegség izgalmas lehetőséget kínál a következő generációs terápia elérhető módjainak újraértékelésére és újabbak létrehozására. Az INAD klinikai diagnosztikai kritériumainak kialakuló kongruenciája várhatóan lendületet ad a fokozott molekuláris diagnosztika felé. Ez az előrelépés várhatóan megfizethető terápiák kifejlesztéséhez vezet, amelyek számszerűsíthető javulást biztosítanának az INAD-betegek életminőségében, késleltetve vagy enyhítve a betegség progresszióját. Kiemeltünk néhány sikertörténetet a Batten-kórban és a mukopoliszacharidózisokban, amelyek inspirációt nyújtanak számunkra, hogy feltegyük a megfelelő kérdéseket, hogy az INAD terápia valósággá váljon. Ezenkívül a CRISPR/Cas9 alapú génszerkesztés növekvő vírusos és nem vírusos megközelítéseinek újabb terápiás utakat kell nyitniuk az INAD számára.

szerzői hozzájárulások

a PB és az FA előzetes tervezetet készített. Az SR és az AC szerkesztette és bővítette a kéziratot. DF, AP és LP szerkesztette a kéziratot.

összeférhetetlenségi nyilatkozat

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.