Molekuláris kifejezések mikroszkópos alapozó: speciális mikroszkópos technikák-fluoreszcencia digitális Képgaléria-Madin-Darby kutya vese hámsejtek (MDCK)

S. H. Madin és N. B. Darby egy felnőtt nőstény cocker spániel veseszövetéből származtatta, az MDCK sejtvonal 1958 szeptemberében keletkezett. Azóta a sejteket széles körben használják a béta-amiloid prekurzor fehérje feldolgozásának, valamint proteolitikus termékeinek válogatásának vizsgálatára.

az MDCK sejtvonal morfológiája epitheliális, a sejtek pedig immunoperoxidáz festéssel pozitívak a keratin szempontjából. Az MDCK-sejtek fogékony vírusai közé tartoznak a hólyagos stomatitis (Indiana törzs), a vaccinia, a coxsackievirus B5, a reovirus 2 és 3, az adenovírus 4 és 5, a sertések hólyagos exanthema és a fertőző kutya hepatitis. A sejtek rezisztenciát mutatnak a coxsackievirus B3 és B4, valamint a poliovírus 2 ellen, és negatívak a reverz transzkriptázra.

az MDCK vonalat általában a hámsejtek általános modelljeként használják, amelyek az epithelium néven ismert szövet típusát tartalmazzák. Elsősorban a belső szerveket és a test egyéb felületeit fedi le, az epithelium szorosan csomagolt sejtekből áll, amelyek lapokba szerveződnek. Ezek a sejtek az alaplemeznek nevezett extracelluláris mátrixot választják ki a bázisukon, amely elősegíti a hámszövet rögzítését a szomszédos szövetekhez. A hámsejteknek nincs közvetlen hozzáférése az erekhez, ezért diffúzió útján oxigént és tápanyagokat kell beszerezniük, ugyanúgy, ahogy kénytelenek megszabadulni az anyagcsere-hulladékoktól. Az Epithelia különféle mechanizmusokban működik, beleértve a védelmet, az abszorpciót, az érzékszervi vételt és a szekréciót. A vesék hámsejtjei kulcsszerepet játszanak a kiválasztó anyagok átmeneti tárolásában és későbbi kiválasztásában.

a fenti digitális képen bemutatott Madin-Darby kutya vesesejtek tenyészetét dapi-val és Alexa Fluor 568-mal jelöltük, amelyek a sejtmagban lévő DNS-t, illetve az F-aktin citoszkeletális hálózatot célozzák meg. Ezenkívül a sejteket peyfp-Mitokondriumokkal (fokozott sárga fluoreszcens fehérje) kiméra plazmid szubcelluláris lokalizációs vektorral transzfektáltuk. A képeket szürkeárnyalatos formátumban rögzítették egy QImaging Retiga Fast-EXi kamerarendszerrel, amely egy Olympus BX-51 mikroszkóppal van felszerelve, amely az Omega Optical által biztosított sáváteresztő emissziós fluoreszcens szűrő optikai blokkokkal van felszerelve. A feldolgozási szakaszban az egyes képcsatornákat álszínezték az egyes fluorofor emissziós spektrális profiloknak megfelelő RGB értékekkel.

MDCK hámsejtek Mitotracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, és DAPI-adherens kultúra Madin-Darby kutya vese sejtek jelölt az intracelluláris mitokondriális hálózat és a fonalas aktin MitoTracker Red CMXRos és Alexa Fluor 488 konjugált falloidin, ill. Az ultraibolya-elnyelő dapi szondát a DNS ellensúlyozására használták.

a peroxiszómák és a Clathrin fehérjék megcélzása Madin-Darby vesesejtekben immunfluoreszcenciával – ebben a szakaszban az MDCK sejtek kiemelt tenyészetét immunfluoreszcens módon jelöltük primer anti-klathrin (nehéz láncú) egér monoklonális antitestekkel, majd a cy3 cianinfestékhez konjugált kecske anti-egér fab fragmensekkel a citoszkeletális hálózat megcélzása érdekében. Ezenkívül a tenyészetben jelen lévő peroxiszómákat immunfluoreszcens módon CI2-vel jelöltük kecske szekunder antitestekkel, amelyek nyúl anti-PMP 70 (peroxiszomális membránfehérje 70) primer antitestekkel szemben irányulnak. A magokat a Hoechst 33342-vel ellensúlyozták.

a mitokondriumok fokozott sárga fehérje szubcelluláris lokalizációja MDCK sejttenyészetekben – a Madin-Darby kutya vese hámsejtjeinek tenyészetét peyfp-Mitokondriumokkal (fokozott sárga fluoreszcens fehérje) transzfektáltuk kiméra plazmid szubcelluláris lokalizációs vektor. A sejteket PHALLOIDINHOZ konjugált SYTOX Orange és Alexa Fluor 350-gyel is megfestették, a DNS-t és a citoszkeletális fonalas aktinhálózatot célozva meg.

a hisztonok és a Golgi komplex immunfluoreszcens célzását Kutyavesék Hámsejtkultúráiban – a Madin-Darby kutyavesesejteket paraformaldehiddel rögzítették, permeabilizálták, és nyúl (anti-giantin) és egér (anti-hisztonok; pan) primer antitestek keverékével kezelték, majd az Alexa Fluor 488-hoz, illetve Texas Red-hez konjugált másodlagos antitestekkel kezelték. A másodlagos antitest koktél tartalmazta a falloidinhoz konjugált Alexa Fluor 350-et is, amelyet úgy terveztek, hogy egyidejűleg megcélozza a fonalas aktinhálózatot.

kettős immunfluoreszcencia nukleáris pórus komplex fehérjék és szoros csomópontok Madin-Darby kutya vese sejtekben – epithelialis sejt szoros csomópontokat és nukleáris pórus komplex fehérjéket egyidejűleg képeztek MDCK sejtekben egér anti-npcp és nyúl anti-ZO-3 primer antitestek koktéljával, majd kecske anti-egér és anti-nyúl szekunder antitestek konjugálva Alexa Fluor 488 és Alexa Fluor 568, ill.

a mitokondriális hálózat MDCK sejtekben – a Madin-Darby kutya vese sejtek tapadó egyrétegű tenyészetét immunfluoreszcens módon jelöltük primer egér anti-oxphos komplex V inhibitor fehérje antitestekkel, majd kecske anti-egér Fab fragmensekkel konjugálva fluoreszcein. A tenyészetet ezt követően megfestették a phalloidinhoz konjugált Alexa Fluor 568-mal, hogy feltárják a fonalas aktinhálózat részleteit, a dapi-t pedig a DNS-hez a magban.

a búzacsíra Agglutinin – Lektinekkel rendelkező MDCK-sejtek a növényi fehérjék speciális osztálya, amelyek a fehérjékhez kötődő vagy a sejtmembránokban lakó specifikus szénhidrátcsoportokhoz kötődnek. Ennek a csoportnak a kiemelkedő tagja, a búzacsíra agglutinint gyakran használják a Golgi komplex lokalizálására fluoreszcencia címkézési kísérletekben. Az ebben a szakaszban bemutatott tenyészetet a texasi vöröshöz konjugált búzacsíra agglutininnel, valamint a falloidinhoz és a dapi-hoz konjugált Alexa Fluor 488-mal (a DNS-t célozva a magban) jelöltük.

a mitokondriumok megcélzása fluoreszcens fehérjékkel kutya vese sejtkultúrákban – az MDCK sejtek félig összefolyó tenyészetét átmenetileg transzfektáltuk egy plazmid kimérával, amely tartalmazza az enhanced yellow fluorescent protein (eyfp) kódoló szekvenciáját, amely a humán citokróm C-oxidáz VIII alegységének mitokondriális célzási szekvenciájához fuzionált. A fixáció és permeabilizáció után a sejteket filamentális aktinra festették a falloidinhoz konjugált Alexa Fluor 546-tal, a DNS-t pedig a nukleáris specifikus festékkel, a DAPI-val.

szoros csomópontok Madin-Darby kutya vese sejtkultúrákban – a zo-3 szoros csomópont fehérjét immunfluoreszcenciával vizualizáltuk mdck sejtek összefolyó tenyészetében. A fehérjét célzó nyúl anti-ZO-3 antitesteket kecske-anti nyúl szekunder Fab fragmensekkel jelöltük meg, amelyek a Cianinfestékhez, a Cy3-hoz konjugáltak. A magokat a DNS-specifikus fluorofor DAPI-val ellensúlyozták.

MDCK tapadó sejttenyészetek Texas Red, Alexa Fluor 488 és Alexa Fluor 350 – egy kettős immunfluoreszcens címkézési kísérletben MDCK sejtek tenyészetét egér anti-hisztonok (pan) és nyúl anti-PMP 70 (peroxiszomális membránfehérje) primer antitestekkel kezelték. A célfehérjéket ezután a Texas Red és az Alexa Fluor 488 konjugált kecske anti-egér és nyúl elleni szekunder antitestekkel vizualizálták. A fonalas aktin citoszkeletális hálózatát a phalloidinhoz konjugált Alexa Fluor 350-gyel ellensúlyozták.

klasszikus festési minták a kutya vese hámsejtjeiben – a MitoTracker Red CMXRos, a falloidinhoz konjugált Alexa Fluor 488 és a Hoechst 33342 ma már hagyományos és népszerű kombinációját használták az MDCK sejtek tapadó tenyészetének hármas jelölésére. Vegye figyelembe a szokatlan fonalas aktinhálózatot,valamint a sejtmagokat körülvevő mitokondriumok nagy számát.

mitokondriumok szubcelluláris lokalizációja fluoreszcens fehérjékkel az MDCK sejtekben – a fixáció és permeabilizáció után az ebben a szakaszban bemutatott MDCK sejtek tenyészetét propidium-jodiddal és Alexa Fluor 350-gyel jelöltük, amely a DNS-t és a fonalas aktint célozza meg. Ezenkívül a sejteket először egy pEYFP-mitokondrium plazmid szubcelluláris lokalizációs vektorral transzfektáltuk, így egy sárga fluoreszcens fehérje címkét lokalizáltunk az intracelluláris mitokondriális hálózathoz.

a Madin-Darby kutya vese epiteliális sejtjeinek Mikrotubulusaiban a kiterjedt Tubulinhálózatot immunfluoreszcenciával festettük, MDCK sejtek rögzített és permeabilizált tenyészetét egér – anti-alfa-tubulin primer antitestekkel kezeltük, majd az Alexa Fluor 568-hoz konjugált kecske-anti-egér antitestekkel. Az atommagokat SYTOX zöld színnel festették. Bár ebben a szakaszban nem ábrázolták, a tenyészetet a következővel is címkézték Alexa Fluor 350 falloidinhoz konjugálva.

KLATHRIN, peroxiszómák és magok egyidejű megjelenítése MDCK sejttenyészetekben – az ebben a szakaszban bemutatott MDCK sejtek tenyészetét immunfluoreszcens módon jelöltük primer anti-klathrin (nehéz láncú) egér monoklonális antitestekkel, majd a cy3 cianinfestékhez konjugált kecske anti-egér fab fragmensekkel a citoszkeletális hálózat megcélzása érdekében. Ezenkívül a tenyészetben jelen lévő peroxiszómákat immunfluoreszcens módon CI2-vel jelöltük kecske szekunder antitestekkel, amelyek nyúl anti-PMP 70 (peroxiszomális membránfehérje 70) primer antitestekkel szemben irányulnak. A magokat a Hoechst 33342-vel ellensúlyozták.

a citokeratin Intermediate Filament Network a kutya vese hámsejtjeiben – a citokeratin a hámsejtek intermedier filament hálózatának gyakori és bőséges összetevője. Az ebben a szakaszban tapadó tenyészetet immunfluoreszcens módon egér anti-citokeratin (pan) primer antitestekkel jelöltük, majd a Marina Blue-hoz konjugált kecske anti-egér szekunder antitestekkel. A mitokondriumokat Mitotracker Red CMXRos-szal vizualizáltuk, a magokat pedig SYTOX Green-vel festettük.

Madin-Darby kutya vese sejtek Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 és Hoechst 33258 – szoros csomópontok és a nukleáris pórus komplex fehérjék (npcp) egyidejű lokalizációját kettős immunfluoreszcens kísérlettel végezték MDCK sejtekkel egér anti-npcp és nyúl anti-ZO-3 primer antitestekkel. A szubcelluláris célpontokat goat Anti-mouse és anti-rabbit szekunder antitestekkel (IgG) vizualizáltuk, melyek az Alexa Fluor 488-hoz, illetve az Alexa Fluor 568-hoz voltak konjugálva. Az atommagokban lévő DNS-t a Hoechst 33258 segítségével ellensúlyoztuk.

a mitokondriális hálózat immunfluoreszcens címkézése MDCK sejttenyészetekben – a Madin-Darby kutya vesesejteket immunfluoreszcens módon jelöltük primer egér anti-oxphos komplex V inhibitor fehérje antitestekkel, majd fluoreszceinhez konjugált kecske anti-egér Fab fragmensekkel. A tenyészetet ezt követően megfestették a phalloidinhoz konjugált Alexa Fluor 568-mal, hogy feltárják a fonalas aktinhálózat részleteit, a dapi-t pedig a DNS-hez a magban.

Mitotracker Red CMXRos, Cy2 és Hoechst 33258 Madin-Darby kutya vese sejtekben – a Madin-Darby kutya vese sejtek rögzített és permeabilizált adherens tenyészetét immunfluoreszcens módon jelöltük elsődleges egér anti-citokeratin antitestekkel, majd a cianinfestékhez (Cy2) konjugált kecske anti-egér fab fragmensekkel. A fixálás előtt a tenyészetet egy órán át MitoTracker Red CMXRos-szal kezeltük, majd az antitestkezelések után a magokat Hoechst 33258-mal ellenfestettük.

a lektinek kötődése a Golgi komplexhez MDCK epiteliális sejttenyészetekben – annak érdekében, hogy az MDCK sejtekben a lektin kötődjön a Golgi komplexhez, egy tapadó tenyészetet kezeltünk búzacsíra agglutinin konjugált Oregon Zöld. A sejteket ezt követően a phalloidinhoz konjugált Alexa Fluor 568-mal, a fonalas aktinhálózat lokalizálására, a nukleinsavfestékkel pedig a dapi-t festették a DNS jelölésére a magban.

adherens MDCK sejteket Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 és Hoechst 33342 – Alexa Fluor színezékeket alkalmaztak a clathrin és a peroxiszomális membránfehérje 70 (PMP 70) eloszlásának vizualizálására Madin-Darby kutya vese hámsejtjeiben. Az immunfluoreszcens reakciók után a sejteket Hoechst 33342-vel ellenfestettük, hogy feltárjuk a magok helyét.

Madin-Darby kutya vese sejtek Mitotracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488, és DAPI – az egyik leghasznosabb fluorofor kombinációk megjelenítésére belső celluláris részletek tartalmazza MitoTracker Red CMXRos megcélozni mitokondriumok, Alexa Fluor 488 konjugált phalloidin a fonalas aktin hálózat, és DAPI lokalizálni a magok.

a mikrotubulus és aktin citoszkeletális hálózatok vizualizálása MDCK sejttenyészetekben – az MDCK sejtekben mind az aktin, mind a tubulin hálózatok egyidejű vizualizálása érdekében egy fix és permeabilizált tenyészetet kezeltünk egér anti-alfa-tubulin primer antitestekkel, majd egy kecske anti-egér szekunder antitesteket, amelyek az Alexa Fluor 568-hoz konjugáltak, összekeverve a falloidinhoz konjugált Alexa Fluor 350-el. Az atommagokat SYTOX zöld színnel festették.

a Madin-Darby kutya vese sejtjeiben a nukleáris Póruskomplex fehérjék és a szoros csomópontok kettős Immunfluoreszcenciáját – a hámsejt szoros csomópontjait és a nukleáris póruskomplex fehérjéket egyidejűleg képezték MDCK sejtekben egér anti-npcp és nyúl anti-ZO-3 primer antitestek koktéljával, majd az Alexa Fluor 568-hoz és Alexa Fluor 488-hoz konjugált kecske anti-egér és nyúl elleni szekunder antitestekkel. A magokat a Hoechst 33258-mal ellensúlyozták.

a mag és a Golgi komplex közelsége egyrétegű MDCK sejttenyészetekben – a Golgi komplex és a magok közötti közelséget Madin-Darby kutya vese sejtjeiben kettős immunfluoreszcens kísérletben vizsgálták egér anti-npcp (nuclear pore complex protein) és nyúl anti-giantin (Golgi complex) primer antitestekkel. Az antitest célpontokat az Alexa Fluor 568-hoz, illetve az Alexa Fluor 488-hoz konjugált kecske szekunder antitestekkel vizualizáltuk, míg az aktin citoszkeletális keretrendszerét a falloidinhoz konjugált Alexa Fluor 350-gyel jelöltük.