I dati di sequenziamento di alta qualità sono una parte importante per garantire che i dati siano affidabili e replicabili e ottenere dati di sequenziamento di alta qualità significa utilizzare materiale di partenza di alta qualità. Per i dati RNA-seq, ciò significa utilizzare RNA che ha un elevato RIN (RNA Integrity Number), una scala di 10 punti da 1 a 10 che fornisce un numero standardizzato ai ricercatori che indica la qualità del loro RNA, rimuovendo il bias individuale e l’interpretazione dal processo.
Il RIN è un miglioramento significativo rispetto al modo in cui l’integrità dell’RNA è stata precedentemente calcolata: il rapporto 28S e 18S. Poiché 28S è di circa 5 kb e 18S è di circa 2 kb, il rapporto ideale 28S:18S è 2.7:1–ma il benchmark è considerato circa 2:1. Tuttavia, questa misurazione si basa sul presupposto che la qualità di rRNA (una molecola molto stabile) rifletta linearmente la qualità dell’mRNA, che in realtà è molto meno stabile e sperimenta un maggiore turnover .
Figura 1: Tracce di RNA di campioni di RNA con diversi valori di RIN. Si noti la differenza tra campioni di alta e bassa qualità.
Fortunatamente, Agilent Technologies ha sviluppato un metodo migliore: il valore RIN. Agilent ha sviluppato un sofisticato algoritmo che calcola il valore RIN, una misura che è un notevole miglioramento rispetto al rapporto 28S:18S. RIN è un miglioramento in quanto tiene conto della totalità del campione di RNA, non solo le misurazioni rRNA, come si può vedere in Figura 1
L’importanza dell’integrità dell’RNA nel determinare la qualità dell’espressione genica è stata esaminata da Chen et al. nel 2014 confrontando campioni di RNA di 4 diversi numeri RIN (da 4.5-9.4) e 3 diversi metodi di preparazione della libreria (poli-A selezionato, rRNA-impoverito, e RNA totale) per un totale di 12 campioni. Hanno quindi calcolato il coefficiente di correlazione dell’espressione genica tra l’RNA di altissima qualità e i campioni più degradati tra i metodi di preparazione della libreria.
Figura 2: Solo i preparati della libreria di RNA selezionati da poli-A subiscono una diminuzione della qualità dei dati con una diminuzione del valore RIN.
Affascinante, l’unico metodo di preparazione della libreria che ha mostrato una significativa diminuzione della correlazione tra RNA di alta qualità e di bassa qualità è stato il metodo di preparazione della libreria selezionato poly-A. Gli altri due metodi di preparazione della libreria avevano ancora coefficienti di correlazione superiori a 0,95 anche a bassi RINs (vedi Figura 2 )!
Chen et al. teorizza che la ragione di ciò è che i campioni degradati selezionati in poly-A si tradurranno in una preparazione della libreria sempre più parziale di 3′ e che quindi perderai preziose letture dai tuoi dati. Poiché gli altri metodi non comportano alcun trattamento o rimozione di rRNA (al contrario della selezione), ci sarà considerevolmente meno bias nel campione complessivo.
Anche se sembra che solo il metodo di preparazione della libreria selezionato da poly-A soffra di avere un basso RIN, i fornitori preferiscono ancora lavorare con campioni di RNA di qualità relativamente alta per tutti i metodi di preparazione della libreria. Tuttavia, se si dispone di campioni importanti che sono di qualità inferiore RIN, può valere la pena ancora discutere le opzioni con un fornitore direttamente-e noi di Genohub siamo più che felici di contribuire a facilitare le vostre discussioni! Vi preghiamo di contattarci qui se avete ulteriori domande sul sequenziamento di campioni con scarsa RIN.