Epstein – Barr Virus – (EBV -) vereeuwigde Lymfoblastoïde cellijnen (LCL ‘ s) drukken een hoog niveau van CD23 maar een laag CD27 uit om hun groei te ondersteunen

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is een van de veel voorkomende menselijke herpesvirustypen in de wereld. Het is bekend dat EBV meer dan 95% van de volwassenen in de wereld infecteert. Het virus infecteert voornamelijk B-lymfocyten en kan de cellen vereeuwigen en omzetten in EBV-dragende lymfoblastoïde cellijnen (LCLs). Beperkte studies zijn gericht op het karakteriseren van de oppervlakte marker expressie van de vereeuwigde LCL ‘ s. Deze studie toont de generatie aan van 15 LCL ‘ s van zestien reumatoïde artritis (RA) patiënten en een gezonde vrijwilliger die B95-8 marmoset-afgeleide EBV gebruiken. Het succespercentage van de LCL-generatie was 88,23%. Alle CD19 + LCL ‘ s uitgedrukt CD23 (16,94-58,9%) en CD27 (15,74-80,89%) op celoppervlak. Onze gegevens toonden twee verschillende categorieën LCL ‘ s aan (snel – en langzaam groeiende) (p<0,05) op basis van hun verdubbelingstijd. De langzaam groeiende LCL ’s vertoonden een lager CD23-niveau (35,28%) in vergelijking met snelgroeiende LCL’ s (42,39%). De langzaam groeiende LCL ‘ s vertoonden daarentegen een hoger percentage in zowel CD27 alleen als CD23+CD27+ in combinatie. Globaal, kunnen deze bevindingen de correlaties van cellulaire cd23 en CD27 uitdrukking met het proliferatietarief van de gegenereerde LCLs suggereren. De verhogingsuitdrukking van CD23 kan een rol in EBV vereeuwiging van B-cellen en de groei en het behoud van EBV-getransformeerde LCL ‘ s spelen terwijl CD27 uitdrukking remmende gevolgen op LCL proliferatie zou kunnen hebben. Verder onderzoek naar deze speculaties is gerechtvaardigd.

1. Inleiding

Epstein-Barr virus (EBV) heeft wereldwijd meer dan 95% van de volwassenen geïnfecteerd . EBV richt zich voornamelijk op en infecteert B-cellen gevolgd door epitheliale cellen en, in mindere mate, CD4 T-cellen . Infectieuze virionen worden geproduceerd na de lytische replicatie in B-cellen en epitheliale cellen. Na de lytic cyclus, EBV latency volgt en in de besmette B-cellen voor de rest van het leven van het individu aanhoudt . EBV veroorzaakt hoofdzakelijk infectieuze mononucleosis en het is ook nauw verbonden met zowel lymfoïde als epitheliale maligniteiten zoals Burkitt lymfoom, Hodgkin lymfoom, nasofaryngeal carcinoom, en maagkanker .

EBV infecteert B-cellen en kan de B-cellen vereeuwigen en langdurige groeiende LCL ‘ s vormen die consistent de virussen tot expressie brengen . Deze methode is gebruikt in laboratoria om bepaalde menselijke bloed-afgeleide B-cellen te vereeuwigen die later als cultuurmodel voor diverse studies met inbegrip van het onderzoek van de drugbibliotheek op grote schaal, vaccinstudie, en hoge productie biologische studies kunnen worden gebruikt . Van alle, EBV geproduceerd uit B95-8, een marmoset cellijn, lijkt de meest voorkomende en krachtige EBV bron voor B-cel vereeuwiging. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers zich ingespannen om de vereeuwigmakingsmethode en de efficiëntie ervan te verbeteren . Onlangs is aangetoond dat met een kleine wijziging, LCL ‘ s kunnen worden gegenereerd uit een klein volume perifeer bloed zo laag als 0,1 mL . Deze bevinding is vooral nuttig in een situatie waarin het monstervolume beperkt is.

eerdere studies hebben gemeld dat immuuncellen, met name B-cellen en hun subgroepen, een cruciale rol spelen bij de pathogenese van RA . Ondanks het succes van EBV vereeuwiging van B-cellen, is er weinig gedaan op de karakterisering van LCL ‘ s en zijn vergelijking met de ouderlijke B-cellen. In deze studie toonden we aan dat EBV efficiënt B-cellen uit het perifere bloed van RA-patiënten kon vereeuwigen en LCL’ s kon vormen. Vervolgens onderzochten we de expressieniveaus van verschillende B-cellen subpopulatie markers waaronder CD23 en CD27 in zowel LCL ‘ s als hun ouderlijke B-cellen. Deze B-cel subpopulaties zijn eerder in verband gebracht met de klinische presentatie van RA-patiënten. Bijvoorbeeld, zijn de verhoogde B-cellen die CD23 uitdrukken ontdekt in RA-patiënten en zij konden door monoklonale antilichamen worden geblokkeerd . Evenzo werd een verhoogde hoeveelheid CD27 + IgD-geheugen B-cellen ook gemakkelijk gedetecteerd bij patiënten met actieve RA . Aan de andere kant toonden Hu en collega ‘ s aan dat CD27+ B-cellen negatief correleerden met de ziekteactiviteit van RA en bij de patiënten werden aangetast .

in deze studie probeerden we het expressieniveau van CD23 en/of CD27 van B-cellen uit de PBMC ’s en LCL’ s afgeleid van RA-patiënten te evalueren. We onderzochten ook het expressieniveau van CD23 en CD27 met betrekking tot de cellulaire groei van LCL ‘ s.

2. Materialen en methoden

2.1. Patiëntenmonsters

5 ml perifeer bloed van zestien RA-patiënten (Tabel 1) werden verzameld bij Sunway Medical Centre, Maleisië, onder een ethische goedkeuringscode van 011/2017/ER. PBMC ‘ s werden geïsoleerd met behulp van ficoll-Paque (GE Healthcare) methode. Kort, het bloed verzameld in EDTA buis werd verdund 1 op 1 met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en gelaagd op Ficoll-Paque oplossing in een verse centrifugebuis. De buis werd 40 minuten gecentrifugeerd op 400 xg bij kamertemperatuur met lage acceleratie en ‘rem af’. De bovenste laag, namelijk het plasma, werd verzameld en aliquoted alvorens op te slaan bij -80°C. De Buffy coat met PBMC ‘ s werd verzameld met behulp van 3 ml Pasteur pipet en overgebracht naar een verse centrifugebuis. De cellen werden tweemaal gewassen met PBS gevolgd door rpmi-medium met 10% foetaal Runderserum (FBS), voordat cryopreserveerd in 10% DMSO en opgeslagen in vloeibare stikstof opslagtank. 5 ml bloed werd gedoneerd door een gezonde vrijwilliger als controle. De PBMC ‘ s en plasma werden verwerkt en opgeslagen zoals hierboven beschreven. De datum van diagnose, bloedbemonstering, PBMC ‘ s cryopreservatie en EBV vereeuwiging worden weergegeven in aanvullende materialen (Hier beschikbaar).

2.2. Bloedonderzoek en berekening van de ziekteactiviteit

2.3. EBV Immortalization

B95-8 marmoset-afgeleide EBV supernatant was een vriendelijk geschenk van Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research( IMR), Maleisië. B-cellen uit het perifere bloed van de patiënt werden vereeuwigd met behulp van de geconcentreerde EBV supernatant zoals eerder beschreven . De tabel in aanvullende materialen toont de datum van PBMC isolatie en cryopreservatie, lcls vestiging, en de duur van cryopreserveerde PBMC ‘ s opgeslagen in vloeibare stikstof opslagtank. Kort, werd een injectieflacon met eerder cryopreserveerde PBMC ontdooid en het celaantal werd bepaald. De cellen werden aangepast tot 2 x 106/mL met vers ontdooid EBV supernatant en ‘ s nachts geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 in een staande T25-kolf. De volgende dag werd een transformatiemedium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml cyclosporine) aan de kolf toegevoegd. De EBV-geïnfecteerde cellen werden waargenomen onder de microscoop om te zoeken naar rozet-achtige getransformeerde LCLs in clusters. LCLs in passages 3-6 werden gebruikt voor de stroom cytometry analyse en celproliferatie assay.

2.4. Flow Cytometrieanalyse

driekleurige cytometrie werd uitgevoerd op FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson) met monoklonale antilichamen die oppervlakteantigenen identificeren voor T-cellen (CD3/PE, kloon SK7), B-cellen (CD19/BB515, HIB19) en B-cel subsets (CD23/APC, kloon EBV-CS5, en CD27/PE, kloon L128). Oplossing 7aad (via-PROBE) werd aangeschaft om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Alle antilichamen werden gekocht van Becton Dickinson. Kort, cryopreserveerde PBMC ‘ s werden ontdooid en resuspendeerd in 50µL BSA-vlekbuffer (Becton Dickinson) en geïncubeerd bij kamertemperatuur in het donker met vooraf verdunde fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gedurende 30 minuten. PBMCs werden dan tweemaal gewassen met BSA-vlekbuffer en geresuspendeerd in 500µL BSA-buffer voor cytometry stroomanalyse. PBMC-suspensies voor de controle werden volgens dezelfde procedure voorbereid. 20.000 levensvatbare cellen, bepaald door de kleurstof voor de levensvatbaarheid van de cellen, werden omheind en verzameld voor driekleurenanalyse in sets CD3/CD19/CD23 en CD19/CD27/CD23. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van CellQuest Pro-software (Becton Dickinson).

2.5. LCLs-Proliferatietest

om de LCLs in twee categorieën te scheiden (snel – en langzaam groeiende), werd de celproliferatiesnelheid bepaald met behulp van RealTime-Glo MT cell viability assay (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Dit is een niet-luminescentie-gebaseerde analyse die realtime proliferatie van levende cellen in cultuur tot 72 uren kan ontdekken. Kort, 10.000 cellen / put werden gezaaid op een witte vlakke bodem 96-put plaat (Greiner Bio-one) in drievoud. 2X reactiemix werd bereid uit de meegeleverde kit en toegevoegd aan elk putje. De cellen werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 gedurende 1 uur voordat de meting op verschillende tijdstippen werd uitgevoerd.(0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, en 72 uur) met behulp van een luminescentie microplaatlezer (Tecan). De relatieve luminescentie-eenheden (RLUs) versus tijdgrafiek werden uitgezet om de groeicurve van de LCL ‘ s weer te geven. In deze grafiek werd het celaantal vertegenwoordigd door de RLUs. Gebruikend RLUs, werd de verdubbelingstijd (tijd die voor een celaantal wordt vereist om in waarde te verdubbelen) van elke categorie van LCLs berekend gebruikend een multipoint online calculator die voor significantietests werden gebruikt . Deze online tool gebruikt de least squares fitting exponentiële methode om de verdubbelingstijd te berekenen . De groeisnelheid (aantal verdubbelingen per tijdseenheid) werd vervolgens berekend met behulp van de onderstaande formule:De gemiddelde waarde van de verdubbelingstijd van alle LCL’ s was 54,69 uur. Vandaar, deze waarde werd gebruikt als de cutoff en LCL ‘ s met verdubbelingstijd hoger dan 54.69 uur werden gegroepeerd in langzaam groeiende LCL ’s en vice versa voor snel groeiende LCL’ s.

2.6. Statistische analyse

Flowcytometrieanalyse werd uitgevoerd in drie onafhankelijke experimenten voor elke categorie LCL ‘ s, tenzij anders gespecificeerd. De gegevens werden uitgedrukt in gemiddelde waarden standaardafwijkingen (std. dev). De significantie werd bepaald met behulp van niet-parametrische tests (Mann-Whitney en Kruskal-Wallis H) waarbij de gegevens als significant worden beschouwd wanneer p kleiner is dan 0,05.

3. Resultaten en discussie

3.1. Ziekteactiviteit bij proefpersonen

Tabel 1 toont de demografische gegevens van de zestien RA-patiënten en een gezond individu en de resultaten van hun bloedonderzoek van veelgebruikte diagnostische markers voor RA die hun ziekte-activiteiten aangeven. Op basis van de DAS28-CRP-index van 16 RA-patiënten werden 3 van deze patiënten geclassificeerd als hoge ziekteactiviteit, 8 als matige activiteit, 3 als remissie en de overige twee als onbekende status vanwege onvolledige gegevensverzameling.

3.2. Generatie van LCL ‘s

PBMC’ s werden geoogst van de zestien RA-patiënten en één gezonde donor (gelabeld als C) (Tabel 1) en cryopreserveerd. Aliquots van cryopreserveerde PBMC ‘ s werden vervolgens gebruikt voor EBV-infectie. Van de zeventien kolven, werden 15 EBV-getransformeerde LCL ‘ s (behalve 4E en 14A) geproduceerd één week na besmetting waarin zichtbare celclusters vanuit de kolven werden gezien. Wanneer gevisualiseerd onder microscoop, toonde de LCLs typische rozet morfologie met verschillende maten zoals aangegeven door de rode pijlen (figuur 1). Het succespercentage van de LCLs-generatie was 88,23% (15 van de 17).

figuur 1

microscopisch onderzoek van PBMC-afgeleide EBV-vereeuwigde B-cellen van een RA patiënt 8A één week na infectie. Deze vereeuwigde cellen zijn geannoteerd als LCL-8A. rode pijlen tonen de rozet-achtige EBV-vereeuwigde LCL ‘ s op 4x (bovenpaneel), 10x (middenpaneel), en 20x (Onderpaneel) vergrotingen. Schaalbalken zijn in het geel aangegeven.

3.3. Groeisnelheid en verdubbelingstijd berekening van gegenereerde LCL ‘s

vervolgens bepaalden we de groeisnelheid van elke gegenereerde categorie LCL’ s met behulp van een nonlytische en real-time luminescentie-gebaseerde celproliferatietest. Figuur 2 toont de groeicurve van elke categorie LCL ‘ s vertegenwoordigd door de relatieve luminescentie-eenheden (RLUs). Tabel 2 toont de berekende verdubbelingstijd en groeisnelheid van de respectieve LCL ‘ s met behulp van een online rekenmachine . Van de verkregen verdubbelingstijd van elke categorie LCL ‘s, verdelen we de LCL’ s in twee categorieën met behulp van 54.69 uur (Gemiddelde waarde van alle LCL ‘s) als afkapwaarde, wat resulteerde in 10 snel groeiende en 5 langzaam groeiende LCL’ s (tabellen 2 en 4) (p<0,05).

Figuur 2

groeicurven van LCL ‘ s. Relatieve luminescentie-eenheden vertegenwoordigen de uitvoerbaarheidssignalen van cellen op verschillende tijdstippen. De gevulde lijnen vertegenwoordigen de snelgroeiende LCL ’s terwijl de gestippelde lijnen de langzaam groeiende LCL’ s vertegenwoordigen.

3.4. Oppervlaktemarkerexpressie van LCL ‘s

PBMC’ s en overeenkomstige LCL ‘ s werden onderworpen aan flowcytometrieanalyse om hun oppervlaktemarkerexpressie te bepalen, waaronder CD3, CD19, CD23 en CD27. CD3 en CD19 zijn oppervlaktetellers voor respectievelijk T-cellen en B-cellen. Gebruikend PBMCs van patiënt 8A en overeenkomstige LCL-8A als voorbeelden worden geà soleerd, toont figuur 3 Hoe CD3 + T-cellen en CD19 + B-cellen werden geprofileerd en gated door cytometry stroom. Het expressieniveau werd vervolgens gepresenteerd in procenten van het totale aantal geanalyseerde lymfocyten dat 20.000 cellen waren. In de PBMC’ s van de donoren waren 29,78-81,8% T-cellen, terwijl 2,35-45,95% B-cellen bevatten. Na de EBV-transformatie, verminderde de T-celpopulaties tot 0-0. 27% terwijl de B-celpopulaties tot 68.59-89.35% stegen. Dit wijst duidelijk op het succes van B-cel vereeuwiging door EBV die over de T-celpopulatie heeft genomen. CD3 + T-cellen senesced en zou volledig worden afgewassen van de LCL ‘ s.

Figuur 3

T-cel (CD3) en B-cel (CD19) oppervlakte teller profileren door cytometrie stroom. Het bovenste paneel toont de analyse van PBMC ’s geïsoleerd uit patiënt 8A terwijl het onderste paneel de analyse van de overeenkomstige LCL’ s (LCL-8A) toont. R1: 7aad-levende cellen; R2: gated lymfocyten; R3: gated CD3+ T-cellen; R4: gated CD19+ B-cellen.

CD23 is een B-cel activeringsmarker terwijl CD27 een marker voor geheugenb-cellen is . Bij RA-patiënten is eerder gemeld dat verhoogde niveaus van CD23-expressie B-cellen positief correleren met de ziekteactiviteit en dat deze mogelijk als therapeutisch doelwit kunnen dienen . Daarentegen bleken CD27+ B-cellen negatief te correleren met ziekteactiviteit en te zijn aangetast bij RA-patiënten . In de huidige studie konden we geen onderscheid maken tussen het expressiepatroon van CD23 en CD27 in PBMC ’s en LCL’ s (Tabel 3). Figuur 4 toont het gating van CD19+, CD23+, en CD27 + van PBMCs die van patiënt 8A en overeenkomstige LCL-8A door cytometry stroom worden geà soleerd. Van alle LCL ‘ s, terwijl 68,59-89,35% CD19+ waren zoals verwacht, vertonen ze expressie van CD23 (16,94-58,9%) en CD27 (15,74-80,89%). CD23 en CD27 Coe-expressie van B-cellen bedroeg 5,72-41,53% (Tabel 3).

3.5. Correlatie van ziekteactiviteit, expressieniveau van Oppervlaktemarkers en LCL-proliferatie

er werd een statistische analyse uitgevoerd om de correlatie tussen de ziekteactiviteit en de expressies van oppervlaktemarkers te testen; geen enkele daarvan vertoonde echter een significantie. Evenzo correleerde de ziekteactiviteit niet met de groeisnelheid van overeenkomstige LCL ‘ s.

vanaf de verdubbelingstijd van elke categorie LCL ’s werden gemiddelde waarden voor zowel snelgroeiende als langzaam groeiende LCL’ s bepaald en aan statistische analyse onderworpen. Tabel 4 laat een significant verschil zien (p<0.05) in termen van verdubbelingstijd tussen de twee categorieën. Ook werden de gemiddelde waarden van de CD23 -, CD27-en CD23+CD27+ – niveaus van de respectieve categorie bepaald. De snel groeiende LCL ’s hebben een hogere expressie van CD23 (42,39%) in vergelijking met de langzaam groeiende LCL’ s (35,28%). Dit is echter niet statistisch significant (Tabel 4). Omgekeerd waren CD27 expressie en CD23 / CD27 coexpressie lager in de snelgroeiende LCL ’s (respectievelijk 36,15 en 13,36%) in vergelijking met de langzaam groeiende LCL’ s (respectievelijk 51,57% en 19,49%). Wanneer een statistische analyse wordt uitgevoerd, tonen alleen de snelgroeiende LCL ‘ s significant lager in CD27, maar niet CD23/CD27 expressie. Verdere studies met grotere steekproefgrootte zijn vereist om deze bevindingen te valideren.

de hoge expressie van CD23 kan te wijten zijn aan de EBV-infectie of-transformatie. Er is bewijs dat B-cel vereeuwiging zou kunnen steunen op de cellulaire CD23 uitdrukking. De studie toonde aan dat CD23-negatieve B-cellen geïnfecteerd konden worden door EBV, maar niet vereeuwigd konden worden tenzij ze aangevuld werden met specifieke groeifactoren . Een andere studie toonde aan dat EBV-geïnfecteerde B-cellen zich konden ontwikkelen tot twee verschillende subpopulaties: CD58+IL6 – en CD58+IL6+ . De voormalige B-cel subpopulatie actief proliferated terwijl de laatste subpopulatie ophield te prolifereren. De expressie van CD23 kan ook worden geïnduceerd door EBV nuclear antigen 2 (EBNA-2) expressie na de EBV transformatie van B-cellen zoals eerder beschreven in een Burkitt lymfoom (BL) cellijn . In tegenstelling, kan de hogere uitdrukking van CD27 in langzaam groeiende LCL’ s hun remmende gevolgen op de proliferatie van LCL ‘ s suggereren.

4. Conclusies

CD23 zou een stimulerende rol kunnen spelen bij de EBV-transformatie van B-cellen en de groei van de LCL’ s. Onze studies toonden aan dat de snelgroeiende LCL ‘ s hogere CD23-expressie en lagere CD27-expressie en CD23CD27-expressie tentoonstelden. Verdere studies met een grotere steekproefgrootte zijn gerechtvaardigd om de implicatie van de oppervlaktemarkeruitdrukking op het EBV-onderhoud en de cellulaire groei grondig te onderzoeken.

beschikbaarheid van gegevens

de gegevens die zijn gebruikt ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn opgenomen in het artikel.

belangenconflicten

de auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.We willen Dr.Alan Soo-Beng Khoo van Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Maleisië bedanken voor zijn vrijgevigheid door ons te voorzien van de B95-8 marmoset-afgeleide EBV voor ons vereeuwigmakingswerk. Hooi-Yeen Yap is de ontvanger van Sunway University Master ‘ s Degree door Research Scholarship. Dit onderzoek werd gefinancierd door Sunway University Internal Research Grant 2019 (int-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01), en Sunway Medical Centre Research Funds (SRC/002/2017/FR en SRC/003/2017/FR).

aanvullend materiaal

de tabel toont de onderzochte gevallen met datum van diagnose, bloedmonsters, cryopreservatie van PBMC ‘s, EBV-vereeuwiging en duur van cryopreserveerde PBMC’ s. (Aanvullende Materialen)