hoogwaardige sequentiegegevens zijn een belangrijk onderdeel van het waarborgen dat uw gegevens betrouwbaar en repliceerbaar zijn, en het verkrijgen van hoogwaardige sequentiegegevens betekent het gebruik van hoogwaardige grondstoffen. Voor RNA-seq gegevens, betekent dit gebruikend RNA dat een hoog RIN (de Integriteitsaantal van RNA), een 10-puntschaal van 1 – 10 heeft die een gestandaardiseerd aantal aan onderzoekers verstrekt die de kwaliteit van hun RNA wijzen, die individuele bias en interpretatie van het proces verwijderen.
de RIN is een significante verbetering ten opzichte van de manier waarop de RNA-integriteit eerder werd berekend: de 28S-en 18S-ratio. Omdat 28S is ongeveer 5 kb en 18S is ongeveer 2 kb, de ideale 28S: 18S verhouding is 2,7: 1-maar de benchmark wordt beschouwd als ongeveer 2: 1. Nochtans, baseert deze meting zich op de veronderstelling dat de kwaliteit van rRNA (een zeer stabiele molecule) lineair weerspiegeld van mRNA-kwaliteit is, die eigenlijk veel minder stabiel is en hogere omzet ervaart .
figuur 1: RNA-sporen van RNA-monsters met verschillende RIN-waarden. Let op het verschil tussen monsters van hoge en lage kwaliteit.
gelukkig heeft Agilent Technologies een betere methode ontwikkeld: de RIN-waarde. Agilent heeft een geavanceerd algoritme ontwikkeld dat de RIN-waarde berekent, een meting die een aanzienlijke verbetering is ten opzichte van de 28S:18S-verhouding. RIN is een verbetering in die zin dat het rekening houdt met het geheel van het RNA monster, niet alleen de rRNA metingen, zoals u kunt zien in Figuur 1
het belang van RNA integriteit bij het bepalen van de kwaliteit van genexpressie werd onderzocht door Chen et al. in 2014 door RNA – steekproeven van 4 verschillende rin-aantallen (van 4.5-9.4) te vergelijken en 3 verschillende methodes van de bibliotheekvoorbereiding (poly-a geselecteerd, rRNA-uitgeput, en totaal RNA) voor een totaal van 12 steekproeven. Zij berekenden toen de correlatiecoëfficiënt van genuitdrukking tussen hoogste kwaliteitsrna en de meer gedegradeerde steekproeven tussen methodes van de bibliotheekvoorbereiding.
Figuur 2: alleen poly – a geselecteerde RNA-bibliotheekpreparaten ervaren een afname in gegevenskwaliteit met een afname in RIN-waarde.
fascinerend genoeg was de poly-a selected bibliotheekvoorbereidingsmethode de enige bibliotheekvoorbereidingsmethode die een significante afname in de correlatie tussen hoogwaardig en laagwaardig RNA liet zien. De andere twee bibliotheekvoorbereidingsmethoden hadden nog steeds correlatiecoëfficiënten van meer dan 0,95 zelfs bij lage RINs (zie Figuur 2 )!
Chen et al. theoretiseren dat de reden achter dit is dat degraded samples die poly-a geselecteerd zal resulteren in een steeds meer 3′ bevooroordeelde bibliotheek voorbereiding, en dat daarom je waardevolle leest van uw gegevens te verliezen. Omdat de andere methoden geen behandeling of rRNA-verwijdering (in tegenstelling tot selectie) impliceren, zal er aanzienlijk minder bias in de totale steekproef zijn.
hoewel het lijkt alsof alleen de poly-a geselecteerde bibliotheekvoorbereidingsmethode lijdt aan een lage RIN, geven providers nog steeds de voorkeur aan het werken met relatief hoge kwaliteit RNA-monsters voor alle bibliotheekvoorbereidingsmethoden. Echter, als u belangrijke monsters die van lagere kwaliteit RIN, het kan de moeite waard nog steeds bespreken uw opties met een provider rechtstreeks – en wij bij Genohub zijn meer dan blij om te helpen uw discussies te vergemakkelijken! Gelieve ons hier te contacteren als u om het even welke verdere vragen over het rangschikken van steekproeven met slechte RIN hebt.