Epstein-Barr Virus- (EBV-) Immortalized Lymphoblastoid Cell Lines (LCLs) Express High Level CD23 but Low CD27 to Support Their Growth

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is one of the common human herpesvirus types in the world. Wiadomo, że EBV infekuje ponad 95% dorosłych na świecie. Wirus infekuje głównie limfocyty B i może unieśmiertelnić i przekształcić komórki w linie komórkowe limfoblastoidalne (LCLS) zawierające EBV. Ograniczone badania skupiły się na charakteryzowaniu ekspresji markerów powierzchniowych uwiecznionych LCL. Badanie to pokazuje generację 15 LCL u szesnastu pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS) i zdrowego ochotnika stosującego EBV pochodzące z marmozety B95-8. Wskaźnik sukcesu generacji LCL wyniósł 88,23%. Wszystkie CD19 + lcls wyrażały CD23 (16,94-58,9%) i CD27 (15,74-80,89%) na powierzchni komórki. Nasze dane wykazały dwie różne kategorie LCL (szybko i wolno rosnących) (p< 0,05) w oparciu o ich podwojenie czasu. Wolno rosnące LCLs wykazały niższy poziom CD23 (35,28%) w porównaniu do szybko rosnących LCLs (42,39%). Natomiast wolno rosnący LCL wykazywał wyższy odsetek zarówno w samym CD27, jak i cd23+ CD27 + w połączeniu. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te mogą sugerować korelacje komórkowej ekspresji CD23 i CD27 z szybkością proliferacji generowanych LCLs. Zwiększenie ekspresji CD23 może odgrywać rolę w unieśmiertelnianiu komórek B przez EBV oraz w wzroście i utrzymaniu LCL transformowanych przez EBV, podczas gdy ekspresja CD27 może mieć hamujący wpływ na proliferację LCL. Dalsze badania są uzasadnione dla tych spekulacji.

1. Wprowadzenie

wirus Epsteina-Barr (EBV) zainfekował ponad 95% dorosłych na całym świecie . EBV atakuje głównie komórki B, a następnie komórki nabłonkowe i, w mniejszym stopniu, komórki T CD4 . Zakaźne wiriony są wytwarzane w wyniku replikacji litycznej w komórkach B i komórkach nabłonkowych. Po cyklu litycznym opóźnienie EBV następuje i utrzymuje się w zakażonych limfocytach B do końca życia osobnika . EBV powoduje głównie mononukleozę zakaźną i jest również ściśle związany zarówno z nowotworami limfoidalnymi, jak i nabłonkowymi, takimi jak chłoniak Burkitta, chłoniak Hodgkina, rak nosogardzieli i rak żołądka .

EBV infekuje komórki B i może uwiecznić komórki B i tworzyć długotrwałe rosnące LCL, które konsekwentnie wyrażają wirusy . Metoda ta została wykorzystana w laboratoriach do uwiecznienia niektórych ludzkich komórek B pochodzących z krwi, które mogą być później wykorzystane jako model kultury dla różnych badań, w tym badań przesiewowych biblioteki leków na dużą skalę, badań szczepionek i badań biologicznych o wysokiej przepustowości . Spośród wszystkich, EBV produkowany z B95-8, linii komórkowej marmozety, wydaje się być najczęstszym i najsilniejszym źródłem EBV dla nieśmiertelności komórek B. W ostatnich dziesięcioleciach naukowcy włożyli wysiłek w poprawę metody uwieczniania i jej skuteczności . Ostatnio wykazano, że przy niewielkiej modyfikacji, LCLs mogą być generowane z małej objętości krwi obwodowej tak niskie, jak 0,1 mL . Stwierdzenie to jest szczególnie przydatne w okolicznościach, w których objętość próbki jest ograniczona.

poprzednie badania donosiły, że komórki odpornościowe, zwłaszcza komórki B i ich podgrupy, odgrywają kluczową rolę w patogenezie RZS . Pomimo sukcesu EBV immortalization B-cells, niewiele zostało zrobione na charakterystyce LCLs i jego porównanie z rodzicielskich B-cells. W tym badaniu wykazaliśmy, że EBV może skutecznie unieśmiertelniać limfocyty B z krwi obwodowej pacjentów z RZS i tworzyć LCLs. Następnie zbadaliśmy poziomy ekspresji kilku markerów subpopulacji komórek B, w tym CD23 i CD27 w obu LCL i ich rodzicielskich komórkach B. Te subpopulacje limfocytów B były wcześniej związane z kliniczną prezentacją pacjentów z RZS. Na przykład u pacjentów z RZS wykryto podwyższone limfocyty B wykazujące ekspresję CD23 i mogą one zostać zablokowane przez przeciwciała monoklonalne . Podobnie, zwiększoną ilość limfocytów B z pamięcią IgD CD27 + łatwo wykryto u pacjentów z aktywnym RZS . Z drugiej strony, Hu i współpracownicy wykazali, że limfocyty B CD27+ ujemnie korelowały z aktywnością choroby RZS i stwierdzono ich upośledzenie u pacjentów .

w tym badaniu staraliśmy się ocenić poziom ekspresji CD23 i (lub) CD27 komórek B z PBMCs i LCL pochodzących od pacjentów z RZS. Zbadaliśmy również poziom ekspresji CD23 i CD27 w odniesieniu do wzrostu komórkowego LCLs.

2. Materiały i metody

2.1. Próbki pacjentów

5 ml krwi obwodowej od szesnastu pacjentów z RZS (Tabela 1) Pobrano z Sunway Medical Centre, Malezja, zgodnie z etycznym kodeksem zatwierdzającym 011/2017/ER. PBMC wyizolowano metodą Ficoll-Paque (GE Healthcare). Krótko mówiąc, krew zebraną w probówce EDTA rozcieńcza się 1 do 1 sterylną roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i nakłada na roztwór Ficoll-Paque w świeżej probówce wirówki. Rurę odwirowywano w temperaturze 400 xg przez 40 minut w temperaturze pokojowej z niskim przyspieszeniem i „hamulcem”. Górną warstwę, którą jest Plazma, zebrano i podzielono przed przechowywaniem w temperaturze -80°C. warstwę buffy zawierającą PBMC zebrano za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml i przeniesiono do świeżej probówki wirówki. Komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie pożywką RPMI zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), przed krioprezerwacją w 10% DMSO i przechowywaniem w zbiorniku do przechowywania ciekłego azotu. 5 ml krwi zostało oddane od zdrowego ochotnika jako kontrola. PBMC i osocze przetwarzano i przechowywano w sposób opisany powyżej. Data diagnozy, pobranie krwi, kriokonserwacja PBMC i uwiecznienie EBV przedstawiono w materiałach uzupełniających (dostępnych tutaj).

2.2. Badanie krwi i obliczanie aktywności choroby

2.3. EBV Immortalization

B95-8 pochodzący z marmozety supernatant EBV był miłym prezentem od Dr Alana Soo-Benga Khoo, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research (IMR), Malezja. Limfocyty B z krwi obwodowej pacjenta uwieczniono za pomocą stężonego supernatantu EBV, jak opisano wcześniej . Tabela w materiałach uzupełniających przedstawia datę izolacji i kriokonserwacji PBMC, ustanowienie LCL oraz czas trwania kriokonserwowanych PBMC przechowywanych w zbiorniku do przechowywania ciekłego azotu. Krótko, fiolkę wcześniej przechowywanego PBMC rozmrażano i oznaczano numer komórki. Komórki skorygowano do 2 x 106/mL przy użyciu świeżo rozmrożonego supernatantu EBV i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2 w stojącej kolbie T25. Następnego dnia do kolby dodano czynnik przemiany (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml cyklosporyny). Komórki zakażone EBV obserwowano pod mikroskopem, aby szukać przekształconych LCL podobnych do rozety w skupiskach. LCLs w pasażach 3-6 wykorzystano do analizy cytometrii przepływowej i testu proliferacji komórek.

2.4. Analizę cytometrii przepływowej

Trójbarwną cytometrię przeprowadzono na Cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych identyfikujących antygeny powierzchniowe dla komórek T (CD3/PE, klon SK7), komórek B (CD19/BB515, HIB19) i podgrup komórek B (CD23/APC, klon EBV-CS5 i CD27/PE, klon L128). W celu określenia żywotności komórek zakupiono roztwór 7aad (VIA-PROBE). Wszystkie przeciwciała zostały zakupione od Bectona Dickinsona. Krótko mówiąc, krioprezerwowane PBMC rozmrażano i zawieszono w 50 µl buforu barwiącego BSA (Becton Dickinson) i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności z predylutowanymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przez 30 minut. Następnie PBMC przemyto dwukrotnie buforem bejcującym BSA i zawieszono w 500µl buforu BSA do analizy cytometrii przepływowej. W ten sam sposób przygotowano kontrolne zawiesiny PBMC. 20 000 żywych komórek oznaczonych barwnikiem żywotności komórek ogrodzono i zebrano do analizy trójbarwnej w zestawach CD3/CD19/CD23 i CD19/CD27 / CD23. Dane analizowano za pomocą oprogramowania CellQuest Pro (Becton Dickinson).

2.5. Test proliferacji LCLs

aby rozdzielić LCLs na dwie kategorie (szybko – i wolno rosnące), szybkość proliferacji komórek oznaczano przy użyciu testu żywotności komórek w czasie rzeczywistym Glo MT (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Jest to niedotyczny test oparty na luminescencji, który może wykryć proliferację żywych komórek w hodowli w czasie rzeczywistym do 72 godzin. Krótko mówiąc, 10 000 komórek/studnia zostały zaszczepione na białej płaskiej płycie 96-studziennej (Greiner bio-one) w trzech egzemplarzach. 2x mieszaninę reakcyjną przygotowano z dostarczonego zestawu i dodano do każdej studzienki. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 1 godzinę przed pomiarem w różnych punktach czasowych(0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, i 72 godziny) przy użyciu czytnika mikropłytek luminescencyjnych (Tecan). Relative luminescence units (rlus) versus time graph zostały wykreślone w celu pokazania krzywej wzrostu LCLs. Na tym wykresie numer komórki był reprezentowany przez RLUs. Korzystając z RLUs, czas podwojenia (czas wymagany do podwojenia liczby komórek) każdej kategorii LCL został obliczony za pomocą wielopunktowego kalkulatora online, który był używany do testów istotności . To narzędzie online wykorzystuje metodę wykładniczą najmniejszych kwadratów, aby obliczyć czas podwojenia . Tempo wzrostu (liczba podwojeń, które występują na jednostkę czasu) obliczono według poniższego wzoru:Średnia wartość czasu podwojenia wszystkich LCL wynosiła 54,69 godziny. Stąd wartość ta została użyta jako odcięcia i LCLs z czasem podwojenia wyższym niż 54.69 godzin pogrupowano w wolno rosnące LCL i odwrotnie w przypadku szybko rosnących LCL.

2.6. Analiza statystyczna

Analiza cytometrii przepływowej została przeprowadzona w trzech niezależnych eksperymentach dla każdej kategorii LCLs, o ile nie określono inaczej. Dane wyrażono w średnich wartościach odchyleń standardowych (std. dev). Znaczenie określono za pomocą nieparametrycznych testów (Mann-Whitney i Kruskal-Wallis H), w których dane uważa się za istotne, gdy p jest mniejsze niż 0,05.

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Aktywność chorobowa badanych osób

Tabela 1 przedstawia dane demograficzne szesnastu pacjentów z RZS i osoby zdrowej oraz wyniki badań krwi powszechnie stosowanych markerów diagnostycznych RZS wskazujących na aktywność choroby. Na podstawie wskaźnika DAS28-CRP 16 pacjentów z RZS, 3 z tych pacjentów sklasyfikowano jako wysoką aktywność choroby, 8 jako umiarkowaną aktywność, 3 jako remisję, a pozostałych dwóch jako nieznany status z powodu niekompletnego gromadzenia danych.

3.2. Generacja LCLs

PBMC została pobrana od szesnastu pacjentów z RZS i jednego zdrowego dawcy (oznaczonego jako C) (Tabela 1) i poddana krioprezerwacji. Następnie w zakażeniu EBV stosowano porcje Krioprezerwowanych PBMC. Z siedemnastu kolb, 15 LCL przekształconych EBV (z wyjątkiem 4E i 14A) zostało wygenerowanych tydzień po zakażeniu, w którym widoczne skupiska komórek były widoczne z kolb. Podczas wizualizacji pod mikroskopem LCLs wykazały typową morfologię rozety o różnych rozmiarach, jak wskazują czerwone strzałki (rysunek 1). Wskaźnik sukcesu generacji LCLs wyniósł 88,23% (15 z 17).

Rysunek 1

badanie mikroskopowe komórek B pochodzących z PBMC uwiecznionych przez EBV od pacjenta z RZS 8A tydzień po zakażeniu. Te uwiecznione komórki są oznaczone jako LCL-8A. czerwone strzałki pokazują rozety podobne do EBV-uwiecznione LCL w powiększeniach 4x (górny panel), 10x (środkowy panel) i 20x (dolny panel). Paski skali są oznaczone kolorem żółtym.

3.3. Tempo wzrostu i czas podwojenia Obliczanie wygenerowanych LCL

następnie określiliśmy tempo wzrostu każdej Wygenerowanej kategorii LCL przy użyciu nielitycznego testu proliferacji komórek opartego na luminescencji w czasie rzeczywistym. Rysunek 2 przedstawia krzywą wzrostu każdej kategorii LCL reprezentowaną przez względne jednostki luminescencji (rlus). Tabela 2 przedstawia obliczony czas podwojenia i tempo wzrostu poszczególnych LCL za pomocą kalkulatora online . Z uzyskanego czasu podwojenia każdej kategorii LCL, dzielimy LCL na dwie kategorie za pomocą 54.69 godzin (średnia wartość wszystkich LCL) jako wartość odcięcia, co dało 10 szybko rosnących i 5 wolno rosnących LCL (tabele 2 i 4) (p<0,05).

Rysunek 2

krzywe wzrostu LCLs. Względne jednostki luminescencji reprezentują sygnały żywotności komórek w różnych punktach czasowych. Wypełnione linie reprezentują szybko rosnące LCL, podczas gdy linie kropkowane reprezentują wolno rosnące LCL.

3.4. Powierzchniowa ekspresja markerów LCL

PBMC i odpowiadające im LCL poddano analizie cytometrii przepływowej w celu określenia ich powierzchniowej ekspresji markerów, w tym CD3, CD19, CD23 i CD27. CD3 i CD19 są markerami powierzchniowymi odpowiednio dla limfocytów T i limfocytów B. Na przykładzie PBMC wyizolowanych od pacjenta 8A i odpowiadającego mu LCL-8A, Fig.3 pokazuje, w jaki sposób limfocyty T CD3+ i limfocyty B CD19+ były profilowane i bramkowane przez cytometrię przepływową. Poziom ekspresji przedstawiono w procentach z ogólnej liczby analizowanych limfocytów liczących 20 000 komórek. W PBMC dawców 29,78-81,8% stanowiły limfocyty T, podczas gdy 2,35-45,95% stanowiły limfocyty B. Po transformacji EBV populacje limfocytów T zmniejszyły się do 0-0, 27%, podczas gdy populacje limfocytów B zwiększyły się do 68,59-89,35%. To wyraźnie wskazuje na sukces uwiecznienia limfocytów B przez EBV, który przejął populację limfocytów T. Limfocyty T CD3+ ulegają uszkodzeniu i zostaną całkowicie zmyte z LCL.

Rysunek 3

profilowanie markerów powierzchniowych limfocytów T (CD3) i limfocytów B (CD19) metodą cytometrii przepływowej. Górny panel pokazuje analizę PBMC wyizolowanych od pacjenta 8A, podczas gdy dolny panel pokazuje analizę odpowiednich LCL (LCL-8A). R1: 7aad-żywe komórki; R2: bramkowane limfocyty; R3: bramkowane limfocyty T CD3+; R4: bramkowane limfocyty B CD19+.

CD23 jest znacznikiem aktywacji komórek B, podczas gdy CD27 jest znacznikiem dla komórek B pamięci . U pacjentów z RZS podwyższone poziomy limfocytów B wykazujących ekspresję CD23 wykazywały wcześniej dodatnią korelację z aktywnością choroby i mogły potencjalnie służyć jako cel terapeutyczny . Natomiast limfocyty B CD27 + wykazywały ujemną korelację z aktywnością choroby i były upośledzone u pacjentów z RZS . W obecnym badaniu nie udało się rozróżnić wzorca ekspresji CD23 i CD27 w PBMCs i LCLs(Tabela 3). 4 przedstawia bramkowanie CD19+, CD23+ i CD27+ z PBMC wyizolowanych od pacjenta 8A i odpowiadającego mu LCL-8A za pomocą cytometrii przepływowej. Spośród wszystkich LCL, podczas gdy 68,59-89,35% było CD19+ zgodnie z oczekiwaniami, wykazują ekspresję CD23 (16,94-58,9%) i CD27 (15,74-80,89%). Współwystępujące limfocyty B CD23 i CD27 wynosiły 5,72 – 41,53% (Tabela 3).

3.5. Korelacja aktywności choroby, poziomu ekspresji markerów powierzchniowych i proliferacji LCL

przeprowadzono analizę statystyczną w celu zbadania korelacji między aktywnością choroby a ekspresją markerów powierzchniowych; jednak żadna z nich nie wykazała znaczenia. Podobnie aktywność choroby nie korelowała z tempem wzrostu odpowiednich LCL.

z czasu podwojenia każdej kategorii LCLs wyznaczono i poddano analizie statystycznej średnie wartości zarówno dla szybko – jak i wolno rosnących LCLs. W tabeli 4 wykazano istotną różnicę (p<0.05) pod względem podwojenia czasu między dwiema kategoriami. Podobnie wyznaczono średnie wartości poziomów CD23, CD27 i CD23+CD27+ odpowiedniej kategorii. Szybko rosnące LCL mają wyższą ekspresję CD23 (42,39%) w porównaniu do wolno rosnących LCL (35,28%). Nie jest to jednak istotne statystycznie(Tabela 4). Odwrotnie, ekspresja CD27 i współistnienie CD23/CD27 były niższe w szybko rosnących LCLs (odpowiednio 36,15 i 13,36%) w porównaniu do wolno rosnących LCLs (odpowiednio 51,57% i 19,49%). Gdy przeprowadzana jest analiza statystyczna, tylko szybko rosnące LCL wykazują znacznie niższe w ekspresji CD27, ale nie cd23 / CD27. W celu potwierdzenia tych wyników wymagane są dalsze badania z większą liczbą próbek.

wysoka ekspresja CD23 może być spowodowana zakażeniem lub transformacją EBV. Istnieją dowody na to, że uwiecznienie komórek B może polegać na ekspresji komórkowej CD23. Badanie wykazało, że limfocyty B-ujemne CD23 mogą być zakażone przez EBV, ale nie można ich unieśmiertelnić, chyba że uzupełnią je specyficznymi czynnikami wzrostu . Inne badanie wykazało, że zakażone EBV komórki B mogą rozwinąć się w dwie odrębne subpopulacje: CD58+IL6-i CD58+IL6+ . Pierwsza subpopulacja limfocytów B aktywnie się namnażała, podczas gdy druga subpopulacja przestała się namnażać. Ekspresja CD23 może być również indukowana przez ekspresję antygenu jądrowego EBV 2 (EBNA-2) po transformacji EBV komórek B, jak wcześniej opisano w linii komórkowej chłoniaka Burkitta (BL). Natomiast wyższa ekspresja CD27 w wolno rosnących LCL może sugerować ich hamujący wpływ na proliferację LCL.

4. Wnioski

CD23 może odgrywać rolę stymulującą w transformacji EBV komórek B i wzroście LCL. Nasze badania wykazały, że szybko rosnące LCL wykazywały wyższą ekspresję CD23 i niższą ekspresję CD27 i ekspresję CD23CD27. Dalsze badania z większą wielkością próbki są uzasadnione w celu dogłębnego zbadania wpływu ekspresji markera powierzchniowego na utrzymanie EBV i wzrost komórkowy.

dostępność danych

dane użyte do potwierdzenia wyników tego badania są zawarte w artykule.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktów interesów dotyczących publikacji tego artykułu.

podziękowania

chcielibyśmy podziękować Dr Alan Soo-Beng Khoo z Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Malezja, za jego hojność w dostarczaniu nam B95-8 marmoset-derived EBV za naszą pracę unieśmiertelnienia. Hooi-Yeen Yap jest stypendystą Sunway University Master ’ s Degree by Research Scholarship. Badania te zostały sfinansowane przez Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) oraz Sunway Medical Centre Research Funds (SRC/002/2017/FR i SRC/003/2017/FR).

Materiały uzupełniające

tabela przedstawia badane przypadki z datą rozpoznania, pobraniem krwi, kriokonserwacją PBMC, uwiecznieniem EBV i czasem trwania kriokonserwowanych PBMC. (Materiały Uzupełniające)