Molecular Expressões Microscopia Primer: Especializado Técnicas de Microscopia – Fluorescência de Imagem Digital Gallery – Madin-Darby Canine Kidney Células Epiteliais (MDCK)

Derivada por S. H. Madin e N. B. Ora, a partir do tecido renal de uma fêmea adulta, cocker spaniel, a linha de células MDCK originou-se em setembro de 1958. Desde então, as células têm sido amplamente utilizadas para investigar o processamento da proteína precursora beta-amilóide, bem como a triagem de seus produtos proteolíticos.

a morfologia da linha celular MDCK é epitelial, e as células são positivas para a queratina por coloração de Imunoperoxidase. Vírus que as células MDCK são suscetíveis a incluir estomatite vesiculosa( estirpe de Indiana), vaccinia, coxsackievirus B5, reovirus 2 e 3, adenovirus 4 e 5, exantema vesicular de suínos, e hepatite canina infecciosa. As células exibem resistência ao coxsackievírus B3 e B4, bem como poliovírus 2, e são negativos para a transcriptase reversa.

a linha MDCK é comumente usada como um modelo geral para células epiteliais, que compreendem o tipo de tecido conhecido como epitélio. Encontrado principalmente cobrindo os órgãos internos e outras superfícies do corpo, o epitélio é composto de células fortemente embaladas que são organizadas em folhas. Estas células secretam uma matriz extracelular chamada lâmina basal em sua base, o que ajuda a ancorar o tecido epitelial em tecidos adjacentes. As células epiteliais também não têm acesso direto aos vasos sanguíneos e devem, portanto, obter oxigênio e nutrientes através da difusão, da mesma forma que eles são forçados a se livrar de produtos de resíduos metabólicos. O epitélio funciona em uma variedade de mecanismos, incluindo proteção, absorção, recepção sensorial e secreção. As células epiteliais dos rins desempenham um papel fundamental no armazenamento temporário e subsequente secreção de materiais excretores.

a cultura das células renais caninas Madin-Darby apresentada na imagem digital acima foi marcada com DAPI e Alexa Fluor 568 conjugados com falloidina, que se destinam ao ADN no núcleo celular e na rede citoesquelética F-actin, respectivamente. Além disso, as células foram transfectadas com um vetor de localização subcelular pEYFP-mitocôndria (proteína fluorescente amarela melhorada) quimérico plasmídeo. Imagens foram gravadas em tons de cinza com um sistema de câmera Retiga Fast-EXi de QImaging acoplado a um microscópio Olympus BX-51 equipado com blocos ópticos de filtro de fluorescência de bandpass fornecidos pela Omega Optical. Durante a fase de processamento, os canais de imagem individuais foram pseudo-coloridos com valores RGB correspondentes a cada um dos perfis espectrais de emissão de fluoróforos.

MDCK Células Epiteliais com MitoTracker Vermelho CMXRos, Alexa Fluor 488, e DAPI – aderente cultura de Madin-Darby canine kidney células foi marcado para o intracelular mitocondrial de rede e para os filamentos de actina com MitoTracker Vermelho CMXRos e Alexa Fluor 488 conjugated para a faloidina, respectivamente. A sonda que absorve ultravioletas DAPI foi utilizada para contrastainar o ADN.

Segmentação Peroxisomes e Clathrin Proteínas em Madin-Darby Células do Rim com Imunofluorescência – nesta seção, o destaque de cultura de células MDCK foi immunofluorescently rotulados com o principal anti-clathrin (cadeia pesada (mouse) anticorpos monoclonais seguido pelo de cabra anti-mouse fragmentos Fab conjugated para a cyanine corante Cy3, de modo a direcionar o citoesqueleto de rede. Adicionalmente, os peroxissomas presentes na cultura foram imunofluorescentemente rotulados com anticorpos primários CI2 conjugados com anticorpos secundários de cabra dirigidos contra anticorpos primários anti-PMP 70 de coelho (proteína 70 da membrana peroxisómica). Os núcleos foram contrastados com a Hoechst 33342.

Avançado Amarelo Proteína de Localização Subcelular de Mitocôndrias nas Células MDCK Culturas – A cultura da Madin-Darby canine kidney células epiteliais foi transfected com um pEYFP-Mitocôndria (enhanced amarelo proteína fluorescente) quimérica, plasmídeo de localização subcelular do vetor. As células foram também manchadas com SYTOX Orange e Alexa Fluor 350 conjugadas com falloidina, tendo como alvo o ADN e a rede de actina citoesquelética filamentosa, respectivamente.

Imunofluorescência Segmentação das Histonas e Complexo de Golgi em Caninos Renais Epiteliais Culturas de Células – Madin-Darby canine kidney células foram fixadas com paraformaldeído, permeabilized, e tratada com uma mistura de coelho (anti-giantin) e mouse (anti-histonas; pan) primária de anticorpos, seguido por anticorpos secundários conjugados a Alexa Fluor 488 e Texas Vermelho, respectivamente. O cocktail secundário de anticorpos continha também Alexa Fluor 350 conjugado com falloidina, concebido para atingir simultaneamente a rede filamentosa de actina.

Casal de Imunofluorescência do Poro Nuclear Complexo de Proteínas e Junções Apertadas em Madin-Darby Canine Kidney Cells – células Epiteliais junções apertadas e poro nuclear complexo de proteínas foram simultaneamente trabalhada em células MDCK com um coquetel de rato anti-NPCP e de coelho anti-ZO-3 primária de anticorpos, seguido pelo de cabra anti-mouse e anti-coelho anticorpos secundários conjugados a Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 568, respectivamente.

a rede mitocondrial nas células MDCK – uma cultura monolayer aderente das células renais caninas de Madin-Darby foi imunofluorescentemente rotulada com anticorpos proteicos primários do complexo V Do Rato anti-oxfos, seguidos por fragmentos de Fab de cabra anti-rato conjugados com fluoresceína. A cultura foi posteriormente manchada com Alexa Fluor 568 conjugada com falloidina para revelar detalhes da rede filamentosa de actina, e DAPI para DNA no núcleo.

as células MDCK com aglutininas-lectinas de gérmen de trigo são uma classe especializada de proteínas vegetais que se ligam a grupos específicos de hidratos de carbono ligados a proteínas ou que residem em membranas celulares. Um membro proeminente deste grupo, aglutinina de gérmen de trigo é muitas vezes usado para localizar o complexo de Golgi em experimentos de etiquetagem de fluorescência. A cultura ilustrada nesta seção foi rotulada com aglutinina de gérmen de trigo conjugada com vermelho do Texas, bem como Alexa Fluor 488 conjugada com falloidina e DAPI (visando o DNA no núcleo).

Segmentação de Mitocôndrias com Proteínas Fluorescentes em Caninos Renal Culturas de Células – Um semi-confluentes cultura de células MDCK foi transitoriamente transfected com um plasmídeo quimera que contém a sequência codificante para maior amarelo proteína fluorescente (EYFP) fundidos para mitocondrial de segmentação sequência da subunidade VIII humanos citocromo C oxidase. Após fixação e permeabilização, as células foram contrastadas para a actina filamentosa com Alexa Fluor 546 conjugada com falloidina e para o ADN com o corante nuclear específico, DAPI.

junções apertadas em culturas de células renais caninas Madin-Darby-a proteína de junção apertada ZO-3 foi visualizada pela imunofluorescência numa cultura confluente de células MDCK. Os anticorpos anti-ZO-3 do coelho que tinham como alvo a proteína foram marcados com fragmentos Fab secundários anti-cabra conjugados com o corante cianina, Cy3. Os núcleos foram contrastados com o ADN específico de fluoróforo DAPI.

MDCK Aderentes Culturas de Células com Texas Red, Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 350 – Em uma cama de imunofluorescência rotulagem experiência, uma cultura de células MDCK foi tratada com um coquetel de rato anti-histonas (pan) e de coelho anti-PMP 70 (peroxisomal proteína de membrana) primária de anticorpos. As proteínas alvo foram posteriormente visualizadas com anticorpos secundários anti-rato e anti-coelho de cabra conjugados com o vermelho do Texas e Alexa Fluor 488, respectivamente. A rede de citoesqueleto de actina filamentosa foi contrastada com Alexa Fluor 350 conjugada com falloidina.

padrões de coloração clássica nas células epiteliais do rim Canino-a agora tradicional e popular combinação de CMXRos vermelhos MitoTracker, Alexa Fluor 488 conjugado com falloidina, e Hoechst 33342 foi usado para rotular uma cultura aderente de células MDCK. Note a incomum rede de actina filamentosa, e o grande número de mitocôndrias em torno dos núcleos nestas células.

Localização Subcelular das Mitocôndrias com Proteínas Fluorescentes em Células MDCK – Após a fixação e permeabilization, a cultura de células MDCK apresentados nesta secção foi marcada com iodeto de propidium e Alexa Fluor 350 conjugated para a faloidina, que têm como alvo o DNA e filamentos de actina, respectivamente. Além disso, as células foram primeiro transfectadas com um vetor de localização subcelular pEYFP-mitocôndria plasmídeo, localizando assim uma proteína fluorescente amarela para a rede mitocondrial intracelular.

a extensa rede de tubulina em células epiteliais renais de Madin-Darby-os microtúbulos foram manchados usando imunofluorescência ao tratar uma cultura fixa e permeabilizada de células MDCK com anticorpos primários de ratinho anti-Alfa-tubulina seguidos de anticorpos anti-ratinho conjugados com Alexa Fluor 568. Os núcleos foram contrastados com SYTOX Green. Embora não fotografada nesta seção, a cultura também foi rotulada com Alexa Fluor 350 conjugada com falloidina.

exibição Simultânea de Clathrin, Peroxisomes, e Núcleos de Células MDCK Culturas – A cultura de células MDCK apresentados nesta seção foi immunofluorescently rotulados com o principal anti-clathrin (cadeia pesada (mouse) anticorpos monoclonais seguido pelo de cabra anti-mouse fragmentos Fab conjugated para a cyanine corante Cy3, de modo a direcionar o citoesqueleto de rede. Além disso, os peroxissomas presentes na cultura foram imunofluorescentemente rotulados com o Cy2 conjugado com anticorpos secundários de cabra dirigidos contra anticorpos primários anti-PMP 70 de coelho (proteína de membrana peroxisómica 70). Os núcleos foram contrastados com a Hoechst 33342.

a rede de filamentos intermédios da Citoqueratina nas células epiteliais do rim Canino – a Citoqueratina é um componente comum e abundante da rede de filamentos intermédios nas células epiteliais. A cultura aderente nesta secção foi imunofluorescentemente rotulada com anticorpos primários anti-citoqueratina (pan) do Ratinho, seguida de anticorpos secundários anti-ratinho da cabra conjugados com Marina Blue. As mitocôndrias foram visualizadas com CMXRos vermelhos MitoTracker e os núcleos foram manchados com verde SYTOX.

Madin-Darby Canine Kidney Células com Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, e Hoechst 33258 – Simultânea de localização de junções apertadas e o poro nuclear proteínas complexas (NPCP) foi realizada com um duplo imunofluorescência experimento com células MDCK usando o mouse anti-NPCP e de coelho anti-ZO-3 primária de anticorpos. Os alvos subcelulares foram visualizados usando anticorpos secundários de cabra anti-rato e anti-coelho (IgG) conjugados com Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 568, respectivamente. O ADN nos núcleos foi contrastado usando o Hoechst 33258.

a rotulagem Imunofluorescente da rede mitocondrial em culturas de células MDCK – as células renais caninas de Madin-Darby foram imunofluorescentemente rotuladas com anticorpos proteicos primários do complexo V Do Rato anti-oxfos, seguidos por fragmentos de Tecido Do Rato Anti-cabra conjugados com fluoresceína. A cultura foi posteriormente manchada com Alexa Fluor 568 conjugada com falloidina para revelar detalhes da rede filamentosa de actina, e DAPI para DNA no núcleo.

MitoTracker Vermelho CMXRos, Cy2, e Hoechst 33258 em Madin-Darby Canine Kidney Células – fixo e permeabilized aderente a cultura de Madin-Darby canine kidney cells foi immunofluorescently rotulado com principal do mouse anti-cytokeratin anticorpos, seguido pelo de cabra anti-mouse fragmentos Fab conjugated para a cyanine corante, Cy2. Antes da fixação, a cultura foi tratada durante uma hora com CMXRos vermelhos MitoTracker, e após os tratamentos de anticorpos, os núcleos foram contrastados com Hoechst 33258.

ligação das lectinas ao complexo de Golgi em culturas de células epiteliais de MDCK – a fim de visualizar a ligação da lectina ao complexo de Golgi em células MDCK, uma cultura aderente foi tratada com aglutinina de gérmen de trigo conjugada com verde de Oregon. As células foram posteriormente contrastadas com Alexa Fluor 568 conjugadas com falloidina para localizar a rede filamentosa de actina, e a mancha de ácido nucleico DAPI para rotular o DNA no núcleo.

Aderentes Células MDCK com Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, e Hoechst 33342 – Alexa-Fluor corantes foram utilizados para visualizar a distribuição de clathrin e o peroxisomal de membrana proteínas de 70 PMP (70) em uma cultura de Madin-Darby canine kidney células epiteliais. Após as reações de imunofluorescência, as células foram contrastadas com Hoechst 33342 para revelar a localização dos núcleos.

Madin-Darby Canine Kidney Células com MitoTracker Vermelho CMXRos, Alexa Fluor 488, e DAPI – Um dos mais úteis fluoróforo combinações para a visualização interna do celular inclui os detalhes MitoTracker Vermelho CMXRos alvo mitocôndrias, Alexa Fluor 488 conjugated para a faloidina para os filamentos de actina rede, e DAPI para localizar os núcleos.

Visualizando a Microtubule e a Actina do Citoesqueleto Redes em Culturas de Células MDCK – a fim de, simultaneamente, visualizar os de actina e tubulina redes em células MDCK, um fixo e permeabilized cultura foi tratada com o mouse anti-alfa-tubulina primária de anticorpos, seguido por um coquetel de cabra anti-mouse anticorpos secundários conjugados a Alexa Fluor 568 misturados com Alexa Fluor 350 conjugated para a faloidina. Os núcleos foram contrastados com SYTOX Green.

Casal de Imunofluorescência do Poro Nuclear Complexo de Proteínas e Junções Apertadas em Madin-Darby Canine Kidney Cells – células Epiteliais junções apertadas e poro nuclear complexo de proteínas foram simultaneamente trabalhada em células MDCK com um coquetel de rato anti-NPCP e de coelho anti-ZO-3 primária de anticorpos, seguido pelo de cabra anti-mouse e anti-coelho anticorpos secundários conjugados a Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488, respectivamente. Os núcleos foram contrastados com a Hoechst 33258.

Proximidade do Núcleo e Complexo de Golgi em camada única de Células MDCK Culturas – A proximidade entre o complexo de Golgi e núcleos Madin-Darby canine kidney cells foi sondado em uma cama de imunofluorescência experiência com o mouse anti-NPCP (poro nuclear complexo de proteína) e de coelho anti-giantin (complexo de Golgi) primária de anticorpos. Os alvos dos anticorpos foram visualizados com anticorpos secundários da cabra conjugados com Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488, respectivamente, enquanto o quadro do citoesqueleto actino foi marcado com Alexa Fluor 350 conjugado com falloidina.