Noções básicas de Hidrofóbico interação Hidrofóbica de cromatografia (HIC) é um dos mais utilizados métodos de separação e purificação de proteínas no seu estado nativo. O HIC também prova ser bastante útil no isolamento de complexos proteicos e no estudo de dobragem e desdobramento de proteínas. Então, como funciona o HIC? Quais são os princípios por trás desta técnica? Para entender o mecanismo por trás deste tipo de cromatografia, Aqui estão algumas coisas que você definitivamente precisa saber.Como funciona o HIC?
In a nutshell, HIC (also known as ‘salting out’) separates protein molecules using the properties of hydrophobicity. Neste método, as proteínas que contêm regiões hidrofílicas e hidrofóbicas são aplicadas a uma coluna HIC em condições elevadas de tampão salgado.
o sal no tampão (geralmente sulfato de amónio) reduz a solvação dos solutos da amostra e expõe as regiões hidrofóbicas ao longo da superfície da molécula de proteína. Isto facilita a adsorção destas regiões hidrofóbicas para as áreas hidrofóbicas no suporte sólido e precipita (cristalizadores) proteínas fora da solução.
tenha em mente que, ao realizar este tipo de cromatografia, a adição de sais liotróficos aumenta o efeito hidrofóbico e reduz o número e volume de cavidades hidrofóbicas individuais enquanto diminui a concentração de sal resultará em dessorção a partir do suporte sólido. Como tal, a eluição da amostra pode ser facilitada através da diminuição do gradiente de sal. Os modificadores ou detergentes orgânicos ligeiros podem também ser adicionados à tampão de eluição para ajudar no processo de eluição.Usando os princípios de HIC, você pode ligar proteínas de soluções aquosas em vários graus, dependendo da estrutura da sua proteína de interesse, concentração de sal, pH, temperatura e solventes orgânicos usados.Cromatografia De Interacção Hidrofóbica: Descobrindo as teorias subjacentes
existem três teorias principais que podem ajudar a explicar o mecanismo por trás de HIC – (1) a teoria da salga, (2) a teoria termodinâmica e (3) a teoria da tensão superficial ou a teoria das forças de Van der Waals.De acordo com a teoria da salga, os aminoácidos hidrofóbicos formam áreas hidrofóbicas protegidas ao dobrar em solução aquosa, enquanto os aminoácidos hidrofílicos permitem que as proteínas se liguem com as moléculas de hidrogênio na água. Como resultado, a probabilidade de que a proteína se dissolva em água irá aumentar se áreas hidrofílicas suficientes estiverem presentes na superfície das moléculas proteicas.
no entanto, após a adição de sais anti-chaotróficos (tais como sulfato de amónio e sulfato de sódio) na solução, algumas das moléculas de água irão interagir com os íons salinos em vez da parte carregada da proteína. Quando as interacções proteína-proteína na solução se tornam mais fortes do que as interacções solvente-soluto, as moléculas proteicas reagem livremente umas com as outras – permitindo-lhes agregar e eventualmente precipitar-se para fora da solução. Assim, a adição de sal na solução reduz a solubilidade de diferentes proteínas em diferentes proporções.Esta teoria afirma que a interação entre moléculas hidrofóbicas é um processo conduzido pela entropia, baseado na Segunda Lei da Termodinâmica. A interação hidrofóbica entre duas ou mais moléculas não polares em uma solução de solvente polar é um processo espontâneo governado por uma mudança na entropia. No entanto, estas interacções podem ser alteradas através do controlo da temperatura ou da modificação da polaridade do solvente.
como tal, quando uma molécula não polar entra em contacto com um solvente polar como a água, haverá um aumento no grau de ordem das moléculas de solvente que circundam a molécula hidrofóbica. Enquanto a entalpia não aumentar significativamente, isso irá produzir uma diminuição na entropia e fornecer uma mudança positiva geral na energia de Gibbs. Como tal, a dissolução de uma molécula não polar em um solvente polar não ocorrerá espontaneamente uma vez que não é termodinamicamente favorável.No entanto, quando você colocar duas ou mais moléculas não polares em um ambiente polar, as superfícies hidrofóbicas das macromoléculas serão escondidas do ambiente polar e as moléculas hidrofóbicas se agregarão espontaneamente. As moléculas de solvente altamente estruturadas que circundam a superfície exposta das moléculas hidrofóbicas serão deslocadas para a maior parte do solvente constituído por moléculas menos estruturadas. Como consequência, a Entropia aumenta enquanto a energia de Gibbs diminui. Sob tais casos, a interação hidrofóbica torna-se um processo termodinamicamente favorável.Esta teoria sugere que a interação hidrofóbica em HIC é dependente das forças de van der Waals entre proteínas e ligantes imobilizados, uma vez que estas forças aumentam à medida que a estrutura ordenada da água aumenta na presença de salga de sais.