virusul Epstein-Barr – (EBV -) linii celulare Limfoblastoide imortalizate (LCLs) exprimă un nivel ridicat de CD23, dar CD27 scăzut pentru a susține creșterea lor

rezumat

virusul Epstein-Barr (EBV) este unul dintre tipurile comune de herpesvirus uman din lume. EBV este cunoscut pentru a infecta mai mult de 95% dintre adulții din lume. Virusul infectează în principal limfocitele B și ar putea imortaliza și transforma celulele în linii celulare LIMFOBLASTOIDE purtătoare de EBV (LCLs). Studiile limitate s-au concentrat pe caracterizarea expresiei markerului de suprafață al LCL-urilor imortalizate. Acest studiu demonstrează generarea a 15 LCLs de la șaisprezece pacienți cu artrită reumatoidă (RA) și un voluntar sănătos care utilizează EBV derivat din marmoset B95-8. Rata de succes a generației LCL a fost de 88,23%. Toate CD19 + LCLs au exprimat CD23 (16,94-58,9%) și CD27 (15,74-80,89%) pe suprafața celulei. Datele noastre au demonstrat două categorii distincte de LCLs (creștere rapidă și lentă) (p<0,05) pe baza timpului de dublare. LCLs cu creștere lentă a arătat un nivel CD23 mai mic (35,28%) comparativ cu LCLs cu creștere rapidă (42,39%). În schimb, LCL-urile cu creștere lentă au arătat un procent mai mare atât în CD27 singur, cât și în CD23+CD27+ în combinație. În general, aceste constatări pot sugera corelațiile expresiei CD23 și CD27 celulare cu rata de proliferare a LCLs generate. Creșterea expresiei CD23 poate juca un rol în imortalizarea EBV a celulelor B și creșterea și menținerea LCLs transformate de EBV, în timp ce expresia CD27 ar putea avea efecte inhibitoare asupra proliferării LCL. Investigații suplimentare sunt justificate la aceste speculații.

1. Introducere

virusul Epstein-Barr (EBV) a infectat mai mult de 95% adulți la nivel global . EBV vizează și infectează în principal celulele B urmate de celulele epiteliale și, într-o măsură mai mică, celulele T CD4 . Virionii infecțioși sunt produși în urma replicării litice în celulele B și celulele epiteliale. După ciclul litic, latența EBV urmează și persistă în celulele B infectate pentru tot restul vieții individului . EBV provoacă în principal mononucleoza infecțioasă și este, de asemenea, strâns asociată atât cu malignități limfoide, cât și epiteliale, cum ar fi limfomul Burkitt, limfomul Hodgkin, carcinomul nazofaringian și cancerul gastric .

EBV infectează celulele B și ar putea imortaliza celulele B și ar putea forma LCL-uri în creștere pe termen lung, care exprimă în mod constant virușii . Această metodă a fost utilizată în laboratoare pentru a imortaliza anumite celule B derivate din sânge uman, care pot fi utilizate ulterior ca model de cultură pentru diverse studii, inclusiv screening-ul bibliotecii de medicamente la scară largă, studiul vaccinului și Studii Biologice de mare capacitate . Dintre toate, EBV produs din B95-8, o linie celulară marmoset, pare a fi cea mai comună și puternică sursă EBV pentru imortalizarea celulelor B. În ultimele decenii, cercetătorii au depus eforturi pentru a îmbunătăți metoda de imortalizare și eficiența acesteia . Recent, s-a demonstrat că, cu o modificare minoră, LCLs ar putea fi generat dintr-un volum mic de sânge periferic de până la 0,1 mL . Această constatare este deosebit de utilă într-o situație în care volumul eșantionului este limitat.

studiile anterioare au raportat că celulele imune în special celulele B și subseturile lor joacă un rol esențial în patogeneza RA . În ciuda succesului imortalizării EBV a celulelor B, S-a făcut puțin în ceea ce privește caracterizarea LCLs și compararea acesteia cu celulele B parentale. În acest studiu, am demonstrat că EBV ar putea imortaliza eficient celulele B din sângele periferic al pacienților cu RA și ar putea forma LCLs. Apoi am examinat nivelurile de Expresie ale mai multor markeri de subpopulație a celulelor B, inclusiv CD23 și CD27, atât în LCLs, cât și în celulele B parentale. Aceste subpopulații de celule B au fost asociate anterior cu prezentarea clinică a pacienților cu PR. De exemplu, celulele B crescute care exprimă CD23 au fost detectate la pacienții cu PR și ar putea fi blocate de anticorpi monoclonali . În mod similar, cantitatea crescută de celule B cu memorie CD27+IgD a fost, de asemenea, ușor detectată la pacienții cu RA activă . Pe de altă parte, Hu și colegii săi au demonstrat că celulele CD27+ B s-au corelat negativ cu activitatea bolii RA și s-au dovedit a fi afectate la pacienți .

în acest studiu, am căutat să evaluăm nivelul de Expresie al CD23 și/sau CD27 al celulelor B de la Pbmc și LCLs derivate de la pacienții cu PR. De asemenea, am investigat nivelul de Expresie al CD23 și CD27 în ceea ce privește creșterea celulară a LCLs.

2. Materiale și metode

2.1. Probele de pacienți

5 ml de sânge periferic de la șaisprezece pacienți cu RA (Tabelul 1) au fost colectate de la Centrul Medical Sunway, Malaezia, sub un cod de aprobare etică din 011/2017/ER. Pbmc-urile au fost izolate folosind metoda Ficoll-Paque (GE Healthcare). Pe scurt, sângele colectat în tubul EDTA a fost diluat 1 la 1 cu soluție salină tamponată cu fosfat steril (PBS) și stratificat pe soluție Ficoll-Paque într-un tub de centrifugă proaspăt. Tubul a fost centrifugat la 400 xg timp de 40 de minute la temperatura camerei, cu accelerație redusă și oprire a frânei. Stratul superior, care este plasma, a fost colectat și alicotat înainte de a fi depozitat la -80 C. stratul buffy care conține Pbmc-uri a fost colectat cu ajutorul pipetei Pasteur de 3 ml și transferat într-un tub de centrifugă proaspăt. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, urmate de mediu RPMI conținând 10% ser fetal bovin (FBS), înainte de crioconservat în 10% DMSO și depozitat în rezervor de stocare a azotului lichid. 5 ml de sânge au fost donate de la un voluntar sănătos ca control. Pbmc-urile și plasma au fost procesate și depozitate conform descrierii de mai sus. Data diagnosticului, prelevarea de probe de sânge, crioprezervarea PBMCs și imortalizarea EBV sunt prezentate în materiale suplimentare (disponibile aici).

2.2. Analiza sângelui și calculul activității bolii

2.3. Imortalizarea EBV

supernatantul EBV derivat din marmoset B95-8 a fost un cadou amabil de la Dr.Alan Soo-Beng Khoo, unitatea de Patologie Moleculară, Institutul de Cercetări Medicale (IMR), Malaezia. Celulele B din sângele periferic al pacientului au fost imortalizate folosind supernatantul EBV concentrat, așa cum s-a descris anterior . Tabelul din materialele suplimentare prezintă data izolării și crioconservării PBMC, stabilirea LCLs și durata Pbmc crioprezervate stocate în rezervorul de stocare a azotului lichid. Pe scurt, un flacon de PBMC crioprezervat anterior a fost dezghețat și numărul celulei a fost determinat. Celulele au fost ajustate la 2 x 106 / mL folosind supernatant EBV proaspăt dezghețat și incubate peste noapte la 37 C, 5% CO2 într-un balon T25 în picioare. A doua zi, mediul de transformare (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml ciclosporină) a fost adăugat în balon. Celulele infectate cu EBV au fost observate la microscop pentru a căuta LCL-uri transformate în rozetă în grupuri. LCLs în pasajele 3-6 au fost utilizate pentru analiza citometriei în flux și testul de proliferare celulară.

2.4. Analiza citometriei în flux

citometria în trei culori a fost efectuată pe Citometrul de flux FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizând anticorpi monoclonali care identifică antigene de suprafață pentru celulele T (CD3/pe, clona SK7), celulele B (CD19/BB515, HIB19) și subseturile de celule B (CD23/APC, clona EBV-CS5 și CD27/PE, clona L128). Soluția de viabilitate celulară 7aad (VIA-PROBE) a fost achiziționată pentru a determina viabilitatea celulară. Toți anticorpii au fost cumpărați de la Becton Dickinson. Pe scurt, Pbmc-urile crioprezervate au fost dezghețate și omogenizate în 50 unqql de tampon de pete BSA (Becton Dickinson) și incubate la temperatura camerei în întuneric cu anticorpi conjugați fluorocrom prediluați timp de 30 de minute. Pbmc-urile au fost apoi spălate de două ori cu tampon de pete BSA și resuspendate în 500 unqql de tampon BSA pentru analiza citometriei în flux. Suspensiile de Control PBMC au fost pregătite cu aceeași procedură. 20.000 de celule viabile determinate de colorantul de viabilitate celulară au fost închise și colectate pentru analiza în trei culori la seturi de CD3/CD19/CD23 și CD19/CD27/CD23. Datele au fost analizate folosind software-ul Cellquest Pro (Becton Dickinson).

2.5. Testul de proliferare LCLs

pentru a separa LCLs în două categorii (creștere rapidă și lentă), rata de proliferare celulară a fost determinată utilizând testul de viabilitate celulară Glo MT în timp real (Promega), urmând instrucțiunile producătorului. Acesta este un test nonlitic bazat pe luminiscență care poate detecta proliferarea în timp real a celulelor vii în cultură până la 72 de ore. Pe scurt, 10.000 de celule / puț au fost însămânțate pe o placă albă cu 96 de puțuri cu fund plat (Greiner Bio-one) în trei exemplare. Amestecul de reacție 2x a fost preparat din kitul furnizat și adăugat la fiecare godeu. Celulele au fost incubate la 37 C, 5% CO2 timp de 1 oră înainte ca măsurarea să fie luată în diferite momente de timp (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, și 72 de ore) folosind un cititor de microplăci luminescente (Tecan). Unitățile de luminiscență relativă (RLU) față de graficul de timp au fost reprezentate grafic pentru a arăta curba de creștere a LCLs. În acest grafic, numărul celulei a fost reprezentat de RLUs. Folosind RLU – urile, timpul de dublare (timpul necesar pentru ca un număr de celule să se dubleze în valoare) a fiecărei categorii de LCLs a fost calculat folosind un calculator online multipunct care a fost utilizat pentru testele de semnificație . Acest instrument online utilizează cele mai mici pătrate care se potrivesc cu metoda exponențială pentru a calcula timpul de dublare . Rata de creștere (numărul de dublări care apar pe unitate de timp) a fost apoi calculată folosind formula de mai jos:valoarea medie a întregului timp de dublare a LCLs a fost de 54,69 ore. Prin urmare, această valoare a fost utilizată ca limită și LCLs cu timp de dublare mai mare de 54.69 de ore au fost grupate în LCLs cu creștere lentă și invers pentru LCLs cu creștere rapidă.

2.6. Analiza statistică

analiza citometriei în flux a fost efectuată în trei experimente independente pentru fiecare categorie de LCLs, dacă nu se specifică altfel. Datele au fost exprimate în valori medii deviații standard (std. dev). Semnificația a fost determinată folosind teste neparametrice (Mann-Whitney și Kruskal-Wallis H) în care datele sunt considerate semnificative atunci când p este mai mic de 0,05.

3. Rezultate și discuții

3.1. Activitatea bolii la subiecții studiului

Tabelul 1 prezintă datele demografice ale celor șaisprezece pacienți cu PR și ale unui individ sănătos și rezultatele testelor de sânge ale markerilor de diagnostic RA utilizați în mod obișnuit, care indică activitățile bolii lor. Pe baza indicelui DAS28-CRP la 16 pacienți cu pr, 3 dintre acești pacienți au fost clasificați ca activitate crescută a bolii, 8 ca activitate moderată, 3 ca remisiune, iar ceilalți doi ca stare necunoscută din cauza colectării incomplete a datelor.

3.2. Generarea de LCLs

Pbmc a fost recoltată de la cei șaisprezece pacienți cu PR și de la un donator sănătos (etichetat ca C) (Tabelul 1) și crioprezervat. Alicote de Pbmc crioprezervate au fost apoi utilizate pentru infecția cu EBV. Din cele șaptesprezece baloane, 15 LCL-uri transformate de EBV (cu excepția 4E și 14a) au fost generate la o săptămână după infecție, în care s-au văzut grupuri de celule vizibile din baloane. Când au fost vizualizate la microscop, LCL-urile au prezentat morfologie tipică a rozetei cu diferite dimensiuni, așa cum este indicat de săgețile roșii (Figura 1). Rata de succes a generației LCLs a fost de 88,23% (15 din 17).

Figura 1

examinarea microscopică a celulelor B imortalizate EBV derivate din PBMC de la un pacient cu RA 8A la o săptămână după infecție. Aceste celule imortalizate sunt adnotate ca LCL-8A. săgețile roșii arată LCL-urile imortalizate EBV asemănătoare rozetei la măriri de 4x (panoul superior), 10x (panoul din mijloc) și 20x (panoul de jos). Barele de scară sunt indicate în galben.

3.3. Rata de creștere și calculul timpului de dublare a Lcls generate

am determinat apoi rata de creștere a fiecărei categorii generate de LCLs folosind un test de proliferare celulară bazat pe luminescență nonlitic și în timp real. Figura 2 prezintă curba de creștere a fiecărei categorii de LCLs reprezentată de unitățile de luminiscență relativă (RLU). Tabelul 2 prezintă timpul de dublare calculat și rata de creștere a LCL-urilor respective utilizând un calculator online . Din timpul de dublare obținut pentru fiecare categorie de LCLs, împărțim LCLs în două categorii folosind 54.69 ore (valoarea medie a tuturor LCL – urilor) ca valoare limită, ceea ce a dus la 10 LCL-uri cu creștere rapidă și 5 cu creștere lentă (tabelele 2 și 4) (p<0,05).

Figura 2

curbele de creștere ale LCLs. Unitățile de luminiscență Relative reprezintă semnalele de viabilitate ale celulelor în diferite momente de timp. Liniile umplute reprezintă LCL-urile cu creștere rapidă, în timp ce liniile punctate reprezintă LCL-urile cu creștere lentă.

3.4. Expresia markerului de suprafață al LCLs

Pbmc și LCL-urile corespunzătoare au fost supuse analizei citometriei în flux pentru a determina expresia markerului de suprafață, inclusiv CD3, CD19, CD23 și CD27. CD3 și CD19 sunt markeri de suprafață pentru celulele T și, respectiv, celulele B. Folosind ca exemple Pbmc izolate de la pacientul 8a și LCL-8a corespunzător, Figura 3 arată modul în care celulele T CD3+ și celulele B CD19+ au fost profilate și închise prin citometrie în flux. Nivelul de expresie a fost apoi prezentat în procente din numărul total de limfocite analizate care au fost 20.000 de celule. În Pbmc-urile donatorilor, 29,78-81,8% au fost celule T, în timp ce 2,35-45,95% cuprind celule B. În urma transformării EBV, populațiile de celule T s-au redus la 0-0, 27%, în timp ce populațiile de celule B au crescut la 68, 59-89, 35%. Acest lucru indică în mod clar succesul imortalizării celulelor B de către EBV, care a preluat populația de celule T. CD3 + T-celule senesced și ar fi complet spălate de LCLs.

Figura 3

profilarea markerului de suprafață cu celule T (CD3) și celule B (CD19) prin citometrie în flux. Panoul superior prezintă analiza Pbmc izolate de la pacient 8A în timp ce panoul inferior arată analiza LCLs corespunzătoare (LCL-8a). R1: 7aad-celule vii; R2: limfocite închise; R3: celule CD3+ T închise; R4: celule CD19+ B închise.

CD23 este un marker de activare a celulelor B, în timp ce CD27 este un marker pentru celulele B de memorie . La pacienții cu PR, s-a raportat anterior că nivelurile crescute de celule B care exprimă CD23 se corelează pozitiv cu activitatea bolii și ar putea servi drept țintă terapeutică . În schimb, s-a constatat că celulele CD27+ B se corelează negativ cu activitatea bolii și s-a constatat că sunt afectate la pacienții cu PR . În studiul actual, nu am putut diferenția modelul de Expresie al CD23 și CD27 în Pbmc și LCLs (Tabelul 3). Figura 4 descrie închiderea CD19+, CD23+ și CD27 + din Pbmc izolate de la pacientul 8a și LCL-8a corespunzător prin citometrie în flux. Din toate LCL – urile, în timp ce 68,59-89,35% au fost CD19+ așa cum era de așteptat, acestea prezintă expresia CD23 (16,94-58,9%) și CD27 (15,74-80,89%). Celulele B coexprimând CD23 și CD27 au fost 5,72-41,53% (Tabelul 3).

3.5. Corelarea activității bolii, nivelul expresiei markerului de suprafață și proliferarea LCL

a fost efectuată o analiză statistică pentru a testa corelația dintre activitatea bolii și expresiile markerului de suprafață; cu toate acestea, niciuna dintre ele nu a prezentat semnificație. În mod similar, activitatea bolii nu s-a corelat cu rata de creștere a LCLs corespunzătoare.

din timpul de dublare al fiecărei categorii de LCLs, valorile medii atât pentru LCLs cu creștere rapidă, cât și pentru cea lentă au fost determinate și supuse analizei statistice. Tabelul 4 prezintă o diferență semnificativă (p<0.05) în ceea ce privește dublarea timpului între cele două categorii. În mod similar, au fost determinate valorile medii ale nivelurilor CD23, CD27 și CD23+CD27+ din categoria respectivă. LCLs cu creștere rapidă au o expresie mai mare a CD23 (42,39%) comparativ cu LCLs cu creștere lentă (35,28%). Cu toate acestea, acest lucru nu este semnificativ statistic (Tabelul 4). Invers, expresia CD27 și coexpresia CD23 / CD27 au fost mai mici în LCLs cu creștere rapidă (36,15 și, respectiv, 13,36%) comparativ cu LCLs cu creștere lentă (51,57% și, respectiv, 19,49%). Când se efectuează o analiză statistică, numai LCL-urile cu creștere rapidă arată semnificativ mai mici în expresia CD27, dar nu CD23/CD27. Sunt necesare studii suplimentare cu o dimensiune mai mare a eșantionului pentru a valida aceste constatări.

expresia ridicată a CD23 s-ar putea datora infecției sau transformării EBV. Există dovezi care arată că imortalizarea celulelor B s-ar putea baza pe expresia CD23 celulară. Studiul a arătat că celulele B CD23 negative ar putea fi infectate cu EBV, dar nu ar putea fi imortalizate decât dacă se completează cu factori de creștere specifici . Un alt studiu a arătat că celulele B infectate cu EBV s – ar putea dezvolta în două subpopulații distincte: CD58+IL6-și CD58+IL6+ . Prima subpopulație cu celule B a proliferat activ, în timp ce a doua subpopulație a încetat să prolifereze. Expresia CD23 ar putea fi, de asemenea, indusă de expresia antigenului nuclear EBV 2 (EBNA-2) în urma transformării EBV a celulelor B așa cum s-a descris anterior într-o linie celulară de limfom Burkitt (BL). În schimb, expresia mai mare a CD27 în LCLs cu creștere lentă poate sugera efectele lor inhibitoare asupra proliferării LCLs.

4. Concluzii

CD23 ar putea juca un rol stimulator în transformarea EBV a celulelor B și creșterea LCLs. Studiile noastre au arătat că LCL-urile cu creștere rapidă au prezentat o expresie CD23 mai mare și o expresie CD27 mai mică și o expresie CD23CD27. Studii suplimentare cu o dimensiune mai mare a eșantionului sunt justificate pentru a investiga în profunzime implicația expresiei markerului de suprafață asupra menținerii EBV și a creșterii celulare.

disponibilitatea datelor

datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt incluse în articol.

conflicte de interese

autorii declară că nu există conflicte de interese în ceea ce privește publicarea acestui articol.

mulțumiri

am dori să mulțumim Dr.Alan Soo-Beng Khoo de la Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaezia, pentru generozitatea sa în furnizarea de noi cu B95-8 Marmoset-derivate EBV pentru munca noastră de imortalizare. Hooi-Yeen Yap este beneficiarul gradului de masterat al Universității Sunway prin bursă de cercetare. Această cercetare a fost finanțată de Sunway University Internal Research Grant 2019 (int-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) și Sunway Medical Center Research Funds (SRC/002/2017/FR și SRC/003/2017/FR).

materiale suplimentare

tabelul prezintă cazurile studiate cu data diagnosticului, prelevarea de probe de sânge, crioprezervarea PBMCs, imortalizarea EBV și durata PBMCs crioprezervate. (Materiale Suplimentare)