Epstein-Barr-Virus – (EBV -) Immortalized Lymfoblastoidcellinjer (LCL) uttrycker hög nivå av CD23 men låg CD27 för att stödja deras tillväxt

Abstrakt

Epstein-Barr-virus (EBV) är en av de vanliga humana herpesvirustyperna i världen. EBV är känt för att infektera mer än 95% av vuxna i världen. Viruset infekterar främst B-lymfocyter och kan odödliggöra och omvandla cellerna till EBV-bärande lymfoblastoidcellinjer (LCL). Begränsade studier har fokuserat på att karakterisera ytmarköruttrycket för de odödliga LCL: erna. Denna studie visar genereringen av 15 LCL från sexton patienter med reumatoid artrit (RA) och en frisk volontär som använder B95-8 marmoset-härledd EBV. Framgångsgraden för LCL-generationen var 88,23%. Alla CD19 + LCL uttryckt CD23 (16,94-58,9%) och CD27 (15,74-80,89%) på cellytan. Våra data visade två distinkta kategorier av LCL (snabb – och långsamt växande) (p<0.05) baserat på deras fördubblingstid. De långsamt växande LCL: erna visade lägre CD23-nivå (35.28%) jämfört med snabbt växande LCL: er (42.39%). Däremot visade de långsamt växande LCL: erna högre andel i både CD27 ensam och CD23+CD27+ i kombination. Sammantaget kan dessa resultat föreslå korrelationerna av cellulärt CD23-och CD27-uttryck med proliferationshastigheten för de genererade LCL: erna. Öka uttrycket av CD23 kan spela en roll i EBV-odödlighet av B-celler och tillväxt och underhåll av EBV-transformerade LCL medan CD27-uttryck kan ha hämmande effekter på LCL-proliferation. Ytterligare undersökningar är motiverade för dessa spekulationer.

1. Inledning

Epstein-Barr-virus (EBV) har infekterat mer än 95% vuxna globalt . EBV riktar sig främst mot och infekterar B-celler följt av epitelceller och i mindre utsträckning CD4-T-celler . Infektiösa virioner produceras efter den lytiska replikationen i B-celler och epitelceller. Efter den lytiska cykeln följer EBV-latens och kvarstår i de infekterade B-cellerna under resten av individens liv . EBV orsakar främst infektiös mononukleos och det är också nära associerat med både lymfoida och epiteliala maligniteter såsom Burkitt lymfom, Hodgkins lymfom, nasofaryngealt karcinom och magcancer .

EBV infekterar B-celler och kan odödliggöra B-cellerna och bilda långsiktiga växande LCL som konsekvent uttrycker virusen . Denna metod har använts i laboratorier för att odödliggöra vissa humana blod-härledda B-celler som senare kan användas som en kulturmodell för olika studier, inklusive storskalig läkemedelsbiblioteksscreening, vaccinstudie och biologiska studier med hög genomströmning . Bland alla, EBV produceras från B95-8, en marmoset cellinje, verkar vara den vanligaste och potenta EBV källa för B-cell odödlighet. Under de senaste decennierna har forskare ansträngt sig för att förbättra odödlighetsmetoden och dess effektivitet . Nyligen har det visat sig att med en mindre modifiering kan LCL genereras från en liten volym perifert blod så lågt som 0,1 mL . Detta resultat är särskilt användbart under en omständighet där provvolymen är begränsad.

tidigare studier har rapporterat att immunceller, särskilt B-celler och deras delmängder, spelar en central roll i patogenesen av RA . Trots framgången med EBV-odödlighet av B-celler har lite gjorts på karakteriseringen av LCL och dess jämförelse med föräldrarnas B-celler. I denna studie visade vi att EBV effektivt kunde odödliggöra B-celler från RA-patienternas perifera blod och bilda LCL. Vi undersökte sedan uttrycksnivåerna för flera B-celler subpopulationsmarkörer inklusive CD23 och CD27 i både LCL och deras föräldra B-celler. Dessa B-cells subpopulationer har tidigare associerats med den kliniska presentationen av RA-patienter. Till exempel har förhöjda B-celler som uttrycker CD23 detekterats hos RA-patienter och de kan blockeras av monoklonala antikroppar . På liknande sätt detekterades också ökad mängd CD27+IgD – minne B-celler lätt hos patienter med aktiv RA . Å andra sidan visade Hu och medarbetare att CD27+ B-celler negativt korrelerade med sjukdomsaktiviteten hos RA och befanns vara nedsatt hos patienterna .

i denna studie försökte vi utvärdera uttrycksnivån för CD23 och / eller CD27 av B-celler från Pbmc och LCL härledda från RA-patienter. Vi undersökte också uttrycksnivån för CD23 och CD27 med avseende på den cellulära tillväxten av LCL.

2. Material och metoder

2.1. Patientprover

5 ml perifert blod från sexton RA-patienter (Tabell 1) samlades in från Sunway Medical Center, Malaysia, enligt en etisk godkännandekod av 011/2017/er. Pbmc isolerades med Ficoll-Paque (GE Healthcare) – metoden. I korthet späddes blodet som uppsamlades i EDTA-röret 1 till 1 med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skiktades på Ficoll-Paque-lösning i ett nytt centrifugrör. Röret centrifugerades vid 400 xg i 40 minuter vid rumstemperatur med låg acceleration och bromsning. Det översta lagret som är plasman uppsamlades och alikvoterades före lagring vid -80 kcal C. buffybeläggningen innehållande Pbmc uppsamlades med användning av 3 ml Pasteurpipett och överfördes till ett nytt centrifugrör. Cellerna tvättades två gånger med PBS följt av RPMI-medium innehållande 10% fetalt bovint Serum (FBS), innan kryokonserverades i 10% DMSO och lagrades i flytande kvävelagringstank. 5 ml blod donerades från en frisk volontär som kontroll. Pbmc och plasma bearbetades och lagrades som beskrivits ovan. Datumet för diagnos, blodprovtagning, pbmc-kryokonservering och EBV-odödlighet visas i kompletterande material (tillgängligt här).

2.2. Blodprov och Sjukdomsaktivitetsberäkning

2.3. EBV Immortalization

B95-8 marmoset-härledd EBV supernatant var en snäll gåva från Dr.Alan Soo-Beng Khoo, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia. B-celler från patientens perifera blod förevigades med den koncentrerade EBV-supernatanten som tidigare beskrivits . Tabellen i kompletterande material visar datum för pbmc isolering och kryokonservering, LCL etablering, och varaktigheten av kryokonserverade Pbmc lagras i flytande kväve lagringstank. I korthet tinades en injektionsflaska med tidigare kryokonserverad PBMC ut och cellnumret bestämdes. Cellerna justerades till 2 x 106/mL med användning av nyupptinad EBV-supernatant och inkuberades över natten vid 37 c c, 5% CO2 i en stående T25-kolv. Nästa dag tillsattes transformationsmedium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml cyklosporin) i kolven. De EBV-infekterade cellerna observerades under mikroskopet för att leta efter rosettliknande transformerade LCL i kluster. LCL i passager 3-6 användes för flödescytometrianalys och cellproliferationsanalys.

2.4. Flödescytometrianalys

Trefärgscytometri utfördes på FACSCalibur flödescytometer (Becton Dickinson) med användning av monoklonala antikroppar som identifierar ytantigener för T-celler (CD3/PE, klon SK7), B-celler (CD19/BB515, HIB19) och B-cellundergrupper (CD23/APC, klon EBV-CS5 och CD27/PE, klon L128). Cell viability solution 7AAD (VIA-PROBE) köptes för att bestämma cellens livskraft. Alla antikroppar köptes från Becton Dickinson. I korthet tinades kryokonserverade Pbmc och resuspenderades i 50 oc BSA-fläckbuffert (Becton Dickinson) och inkuberades vid rumstemperatur i mörkret med förspädda fluorokromkonjugerade antikroppar i 30 minuter. Pbmc: erna tvättades sedan två gånger med BSA-fläckbuffert och resuspenderades i 500 oc-l av BSA-buffert för flödescytometrianalys. Kontroll pbmc suspensioner framställdes med samma förfarande. 20 000 livskraftiga celler bestämda av cellviabilitetsfärgen var gated och samlades in för trefärgsanalys vid uppsättningar CD3/CD19/CD23 och CD19/CD27/CD23. Data analyserades med hjälp av cellquest Pro-programvara (Becton Dickinson).

2.5. Lcls Proliferation Assay

för att separera LCLs i två kategorier (snabb – och långsamt växande) bestämdes cellproliferationshastigheten med användning av RealTime-Glo MT cell viability assay (Promega) enligt tillverkarens instruktion. Detta är en icke-lyminescensbaserad analys som kan upptäcka realtidsproliferation av levande celler i odling upp till 72 timmar. Kortfattat såddes 10 000 celler/brunn på en vit plattbotten 96-brunnsplatta (Greiner Bio-one) i tre exemplar. 2x reaktionsblandning framställdes från den medföljande satsen och tillsattes till varje brunn. Cellerna inkuberades vid 37 C, 5% CO2 i 1 timme innan mätningen gjordes vid olika tidpunkter (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, och 72 timmar) med hjälp av en luminiscens microplate reader (Tecan). De relativa luminiscensenheterna (RLUs) kontra tidsdiagrammet plottades för att visa tillväxtkurvan för LCL: erna. I denna graf representerades cellnumret av RLUs. Med hjälp av RLU: erna beräknades fördubblingstiden (tid som krävs för att ett cellnummer ska fördubblas i värde) för varje kategori av LCL: er med hjälp av en multipoint online-kalkylator som användes för signifikanstester . Detta onlineverktyg använder minst kvadrater som passar exponentiell metod för att beräkna fördubblingstiden . Tillväxttakten (antalet dubbleringar som inträffar per tidsenhet) beräknades sedan med hjälp av formeln nedan:medelvärdet för alla LCL: s fördubblingstid var 54,69 timmar. Därför användes detta värde som cutoff och LCL med fördubblingstid högre än 54.69 timmar grupperades i långsamt växande LCL och vice versa för snabbt växande LCL.

2.6. Statistisk analys

Flödescytometrianalys utfördes i tre oberoende experiment för varje kategori av LCL, om inte annat anges. Data uttrycktes i medelvärden standardavvikelser (std. dev). Betydelsen bestämdes med användning av icke-parametriska tester (Mann-Whitney och Kruskal-Wallis H) där data anses vara signifikanta när p är mindre än 0,05.

3. Resultat och diskussion

3.1. Sjukdomsaktivitet hos försökspersoner

Tabell 1 visar demografiska data för de sexton RA-patienterna och en frisk individ och deras blodprovresultat av vanliga ra-diagnostiska markörer som indikerar deras sjukdomsaktiviteter. Baserat på DAS28-CRP-indexet på 16 RA-patienter klassificerades 3 av dessa patienter som hög sjukdomsaktivitet, 8 som måttlig aktivitet, 3 som remission och de återstående två som okänd status på grund av ofullständig datainsamling.

3.2. Generering av LCL

Pbmc skördades från sexton RA-patienter och en frisk donator (märkt som C) (Tabell 1) och kryokonserverad. Alikvoter av kryokonserverade Pbmc användes sedan för EBV-infektion. Av de sjutton kolvarna genererades 15 EBV-transformerade LCL (utom 4E och 14a) en vecka efter infektion där synliga cellkluster sågs från kolvarna. När de visualiserades under mikroskop visade LCL: erna typisk rosettmorfologi med olika storlekar som indikeras av de röda pilarna (Figur 1). Framgångsgraden för lcls-generationen var 88,23% (15 av 17).

Figur 1

mikroskopisk undersökning av PBMC-härledda EBV-odödliga B-celler från en RA-patient 8A en vecka efter infektion. Dessa odödliga celler kommenteras som LCL-8A. röda pilar visar de rosettliknande EBV-odödliga LCL: erna vid 4x (övre panelen), 10x (mittpanelen) och 20x (bottenpanelen) förstoringar. Skalstänger anges i gult.

3.3. Tillväxthastighet och Fördubblingstidberäkning av genererade LCL

vi bestämde sedan tillväxthastigheten för varje genererad kategori av LCL med hjälp av en icke-lytisk och realtids-luminiscens-baserad cellproliferationsanalys. Figur 2 visar tillväxtkurvan för varje kategori av LCL som representeras av de relativa luminiscensenheterna (RLUs). Tabell 2 visar den beräknade fördubblingstiden och tillväxttakten för respektive LCL med hjälp av en online-kalkylator . Från den erhållna fördubblingstiden för varje kategori av LCL: er delar vi LCL: erna i två kategorier med 54.69 timmar (medelvärde för alla LCL) som gränsvärde, vilket resulterade i 10 snabbväxande och 5 långsamt växande LCL (tabellerna 2 och 4) (p<0,05).

Figur 2

tillväxtkurvor för LCL. Relativa luminiscensenheter representerar livskraftssignalerna för celler vid olika tidpunkter. De fyllda linjerna representerar de snabbt växande LCL: erna medan prickade linjer representerar de långsamt växande LCL: erna.

3.4. Ytmarköruttryck av LCL

Pbmc och motsvarande LCL utsattes för flödescytometrianalys för att bestämma deras ytmarköruttryck inklusive CD3, CD19, CD23 och CD27. CD3 och CD19 är ytmarkörer för T-celler respektive B-celler. Med hjälp av pbmc isolerade från patient 8A och motsvarande LCL-8a som exempel visar Figur 3 Hur CD3+ T-cellerna och CD19+ B-cellerna profilerades och gatades av flödescytometri. Uttrycksnivån presenterades sedan i procent från det totala antalet analyserade lymfocyter som var 20 000 celler. I donatorernas Pbmc var 29,78-81,8% T-celler medan 2,35-45,95% består av B-celler. Efter EBV-omvandlingen minskade t-cellpopulationer till 0-0, 27% medan B-cellpopulationer ökade till 68,59-89,35%. Detta indikerar tydligt framgången med B-cell odödlighet av EBV som har tagit över t-cellpopulationen. CD3 + T-celler senesced och skulle helt tvättas bort från LCLs.

Figur 3

T-cell (CD3) och B-cell (CD19) ytmarkörprofilering med flödescytometri. Den övre panelen visar analysen av Pbmc isolerade från patient 8A medan den nedre panelen visar analysen av motsvarande LCL (LCL-8A). R1: 7AAD-levande celler; R2: gated lymfocyter; R3: gated CD3+ T-celler; R4: gated CD19+ B-celler.

CD23 är en b-cellaktiveringsmarkör medan CD27 är en markör för minne B-celler . Hos RA-patienter har förhöjda nivåer av CD23-Uttryckande B-celler tidigare rapporterats positivt korrelera med sjukdomsaktiviteten, och de kan potentiellt fungera som ett terapeutiskt mål . Däremot visade sig CD27+ B-celler negativt korrelera med sjukdomsaktivitet och visade sig vara nedsatt hos RA-patienter . I den aktuella studien kunde vi inte skilja uttrycksmönstret för CD23 och CD27 i Pbmc och LCL (tabell 3). Figur 4 visar grinden av CD19+, CD23+ och CD27+ från Pbmc isolerade från patient 8A och motsvarande LCL-8A genom flödescytometri. Från alla LCL, medan 68.59-89.35% var CD19+ som förväntat, uppvisar de uttryck av CD23 (16.94-58.9%) och CD27 (15.74-80.89%). B-celler som samuttrycker CD23 och CD27 var 5,72-41,53% (tabell 3).

3.5. Korrelation av sjukdomsaktivitet, Ytmarköruttrycksnivå och LCL-Proliferation

en statistisk analys utfördes för att testa korrelationen mellan sjukdomsaktiviteten och ytmarköruttryck; emellertid visade ingen av dem betydelse. På liknande sätt korrelerade sjukdomsaktiviteten inte med tillväxttakten för motsvarande LCL.

från fördubblingstiden för varje kategori av LCL bestämdes medelvärden för både snabb – och långsamt växande LCL och utsattes för statistisk analys. Tabell 4 visar en signifikant skillnad (p< 0.05) när det gäller fördubbling tid mellan de två kategorierna. På samma sätt bestämdes medelvärdena för CD23 -, CD27-och CD23+CD27+ – nivåerna i respektive kategori. De snabbt växande LCL: erna har högre uttryck för CD23 (42,39%) jämfört med de långsamt växande LCL: erna (35,28%). Detta är dock inte statistiskt signifikant (Tabell 4). Omvänt var CD27-uttryck och CD23/CD27-samuttryck lägre i de snabbt växande LCL: erna (36,15 respektive 13,36%) jämfört med de långsamt växande LCL: erna (51,57% respektive 19,49%). När en statistisk analys utförs visar endast de snabbt växande LCL: erna signifikant lägre i CD27 men inte CD23/CD27-uttryck. Ytterligare studier med större provstorlek krävs för att validera dessa resultat.

det höga uttrycket av CD23 kan bero på EBV-infektion eller transformation. Det finns bevis som visar att B-cell odödlighet kan förlita sig på det cellulära CD23-uttrycket. Studien visade att CD23-negativa B-celler kunde infekteras av EBV men kunde inte odödliggöras om de inte kompletterades med specifika tillväxtfaktorer . En annan studie visade att EBV-infekterade B-celler kunde utvecklas till två distinkta subpopulationer: CD58+IL6 – och CD58+IL6+ . Den tidigare B-cell-subpopulationen prolifererade aktivt medan den senare subpopulationen upphörde att proliferera. Uttrycket av CD23 kan också induceras av EBV nukleärt antigen 2 (EBNA-2) uttryck efter EBV transformation av B-celler som tidigare beskrivits i en Burkitt lymfom (BL) cellinje . Däremot kan det högre uttrycket av CD27 i långsamt växande LCL föreslå deras hämmande effekter på LCL: s proliferation.

4. Slutsatser

CD23 kan spela en stimulerande roll i EBV-transformation av B-celler och LCL: s tillväxt. Våra studier visade att de snabbt växande LCL: erna uppvisade högre CD23-uttryck och lägre CD27-uttryck och CD23CD27-uttryck. Ytterligare studier med större provstorlek är motiverade för att undersöka djupet på implikationen av ytmarköruttrycket på EBV-underhåll och cellulär tillväxt.

datatillgänglighet

de data som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i artikeln.

intressekonflikter

författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter angående publiceringen av denna artikel.

bekräftelser

vi vill tacka Dr Alan Soo-Beng Khoo från Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia, för hans generositet i att förse oss med B95-8 marmoset-härledd EBV för vårt odödlighetsarbete. Hooi-Yeen Yap är mottagare av Sunway University magisterexamen genom forskningsstipendium. Denna forskning finansierades av Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) och Sunway Medical Center Research Funds (SRC/002/2017/FR och SRC/003/2017/FR).

kompletterande material

tabellen visar de studerade fallen med diagnosdatum, blodprovtagning, pbmc-kryokonservering, EBV-odödlighet och varaktighet av kryokonserverade Pbmc. (Kompletterande Material)