förbättrat uttryck av PEPCK mRNA
den cytosoliska isoformen av PEPCK är en primär plats för reglering av både lever-och njurglukoneogenes (71). Denna aktivitet regleras emellertid inte av allosteriska mekanismer eller genom kovalenta modifieringar. Istället regleras det enbart av mekanismer som bestämmer nivån av PEPCK-mRNA och därmed kontrollerar nivån av PEPCK-proteinet. Detta åstadkommes genom förändringar i antingen synteshastigheten eller nedbrytningshastigheten för PEPCK-mRNA. Pck1-genen som kodar för den cytosoliska PEPCK består av 10 exoner och 9 introner och är ungefär 6 kb lång (13). Det kodar för en enda 2,6 kb mRNA som översätts till ett protein som innehåller 621 aminosyror och har en massa på 69 300 Da. Nivån av PEPCK-mRNA i råttnjur ökar snabbt efter akut acidos (80). Ökningen initieras inom 1 timme och når maximalt inom 7 timmar på en nivå som är sexfaldig större än normalt. Transkription avrinningsexperiment (80) indikerade att förändringar i den relativa transkriptionshastigheten för pck1-genen står för den initiala induktionen av PEPCK mRNA. Vidare korrelerade de observerade förändringarna i PEPCK-mRNA-nivåer nära med tidigare data som mätte förändringar i de relativa hastigheterna för PEPCK-proteinsyntes hos normala och acidotiska råttor (84). Den sexfaldiga inducerade nivån av PEPCK mRNA upprätthålls emellertid hos råttor som görs kroniskt acidotiska trots att den relativa transkriptionshastigheten gradvis minskar och platåer på en nivå som bara är dubbelt större än observerad hos normala råttor (81).
olika segment av PEPCK-promotorn, såväl som kärnpromotorn (-460 till +73 bp) innehållande specifika blockmutationer i regulatoriska element har analyserats omfattande i transgena djur för att bestämma deras roll vid kontroll av PCK1-genuttryck (72). Wildtype – kärnpromotorn smält till bovint tillväxthormon (bGH) – genen innehåller all information som är nödvändig för att säkerställa lämpligt uttryck och hormonell reglering i levern. Ett större 2.3-kb-segment av PEPCK-promotorn krävdes för att driva expression av transgenen i fettvävnad. Båda dessa konstruktioner uttrycktes emellertid vid låga nivåer i njurarna. Däremot en CRC362 transgen som innehåller endast 362 bp av promotorn men alla nedströms exoner och introner av råtta PCK1 genen uttrycktes vid normala nivåer i njuren (40). Denna transgen skilde sig från den endogena genen endast genom substitution av ett segment av kyckling PCK1-genen i den del av den slutliga exon som kodar för 3′ – UTR av PEPCK mRNA. Vidare uppvisar den senare konstruktionen en signifikant njurspecifik induktion när de transgena mössen gjordes acidotiska (20).
LLC-PK1-F + – celler uppvisar en pH-responsiv induktion av PEPCK mRNA (64). Tidigare försök att identifiera ett pH-responsivt element genom övergående uttryck av olika PEPCK-kloramfenikolacetyltransferasreporter-konstruktioner i LLC-PK1-F+ – celler gav motstridiga resultat (21, 77). Dessa studier visade emellertid tydligt att bindning av HNF-1 till P2-elementet är väsentligt för basalt uttryck av renal PEPCK och att denna protein:DNA-interaktion kan bidra till ökat uttryck under acidos. Luciferas-konstruktioner innehållande antingen 490 eller 2300 bp av PEPCK-promotorn aktiveras starkt genom kotransfektion av LLC-PK1-F+ – celler med den katalytiska subenheten av proteinkinas A (112). Ingen av konstruktionerna uppvisar emellertid en ökad aktivitet när de transfekterade cellerna överfördes till surt medium (pH 6,9, 10 mM HCO−3) (Wall Q et al., opublicerade data, 1999). Denna observation och upptäckten att en transgen som innehåller endast 362 bp av promotorn tillsammans med nedströms exoner och introner är tillräcklig för att rekapitulera den pH-responsiva induktionen (20) antyder att PEPCK-genen kan innehålla ett nedströmselement som är väsentligt för den pH-responsiva ökningen av transkription. Andra experiment har visat att C / EBP (112) och ATF-2 (44) binder till CRE-1-elementet i PEPCK-genen i njure.
tidigare studier har också visat att halveringstiden för PEPCK-mRNA ökar i levern som svar på cAMP (76) och glukokortikoider (132). Ökad stabilitet kan också bidra till fortsatt induktion av renal PEPCK mRNA under kronisk acidos (81). Därför kan selektiv mRNA-stabilisering också spela en viktig roll i den fysiologiska regleringen av PEPCK-genuttryck. Det tetracyklinresponsiva promotorsystemet användes för att kvantifiera halveringstiden för olika chimära mRNA i LLC-PK1-F+-celler (67).
mRNA, som innehåller hela 3′-UTR av PEPCK mRNA, försämrades med en halveringstid på 1, 2 timmar. RNase h-behandling indikerade att snabb deadenylering inträffade samtidigt med nedbrytning av mRNA-mRNA för rnase H. Tidigare studier (108) indikerade att PCK-7, ett 50-nt-segment vid 3′-änden av 3′ – UTR, binder ett oidentifierat protein som kan bidra till det snabba förfallet av PEPCK-mRNA. Emellertid har den chimära mRNA uscug-PCK – 7 en halveringstid på 17 timmar. Inkludering av det intilliggande PCK-6-segmentet, en 23-BP AU-rik region, producerade mRNA-6/7 mRNA som har en halveringstid på 3,6 timmar. Den mRNA som innehåller 3′-Halvdelen av 3′-UTR har försämrats med samma halveringstid. Överraskande nog försämrades också mRNA-PCK-2, som innehåller 5′-änden av 3′-UTR, snabbt (t1/2 = 5, 4 timmar). RNA gel-shift-analyser visade att AUF1 binder till PCK-7, PCK-6 och PCK-2 segment med hög affinitet och specificitet. Mutationsanalys indikerar att AUF1 binder till en uuau-UUUAU-sekvens inom PCK – 6 och en stam-loop-struktur och angränsande CU-region av PCK-7. Således binder AUF1 till flera destabiliserande element inom 3 ’ – UTR som deltar i den snabba omsättningen av PEPCK mRNA. Nyare experiment tyder på att PCK-7-segmentet också binder Kazaki-kristallin/NADPH: kinonreduktas med hög affinitet och specificitet (Hajarnis och Curthoys, opublicerade data, 2006). Således kan samma mekanism som står för den mer gradvisa induktionen av GA-och GDH-mRNA också bidra till den ihållande ökningen av PEPCK-mRNA-nivåer under kronisk acidos.