TEXT
Arsen je třída I lidský karcinogen, který představuje zdravotní riziko pro člověka. Expozice arsenu je spojena s rakovinou kůže, rakovinou močového měchýře, cukrovkou, kardiovaskulárním onemocněním a onemocněním periferních cév (1, 2). AMERICKÁ Agentura pro Ochranu Životního prostředí (EPA) řadí arsen první na jeho Superfund Seznam Nebezpečných Látek (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
Arsen je uvolňován do prostředí, geotermální činnost, tím, že rozpouštění minerálů, a tím, že antropogenní činnosti, průmyslových odpadních vod, spalování fosilních paliv a používání arsenu obsahující pesticidy, herbicidy, konzervační přípravky na dřevo, a doplňkové látky v krmivech (3). V důsledku použití zavlažovací vody kontaminované arsenem se arsen hromadí v rýži, která je základem stravy pro polovinu světové populace (4). Methylace arsenu je detoxikační cesta (5, 6). Mnohé organismy mají geny, které kódují arsenite S-adenosylmethionin (SAM) methyltransferases (nazval ArsM v mikroby a AS3MT ve vyšší organismy), které biotransformovat As(III) do methylovaných druhů, s těkavými netoxický trimethylarsine (7) jako konečný produkt (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida je gramnegativní bakterie nacházející se ve vodě a půdě, zejména v rhizosféře při relativně vysoké hustotě obyvatelstva (10). Tento mikroorganismus byl rozsáhle studován jako model pro biodegradaci aromatických sloučenin, jako je naftalen (11) a styren (12, 13). Konvenční sanační metody, jako je výkop půdy následovaný koagulační filtrací nebo iontovou výměnou, jsou drahé, rušivé a nejsou široce používány (14). Sphingomonas desiccabilis a Bacillus idriensis vyjádření arsM můžete odstranit arzénu z kontaminované půdy, ale výraz z plasmidu omezuje jejich užitečnost (15). Druhy Pseudomonas mají vyhlídku na rhizoremediaci organických sloučenin (16), ale nebyly použity k odstranění arsenu.
cílem této studie bylo vytvořit kmen P. putida KT2440 s možností odstranění arsenu z kontaminované půdy. Použili jsme Gen Chlamydomonas reinhardtii arsM kódující arsm orthologue (CrArsM). In vitro se purifikovaný CrArsM methyloval jako (III)na různé druhy (viz obr. S1A v doplňkovém materiálu). Po 7 hodinách se methylarsenit a dimethylarsenát vyráběly v relativně stejných množstvích. Po 14 hodinách byl produktem primárně DMAs (V), s menším množstvím trimethylarsinoxidu a bez MAs(III). Tyto výsledky jsou v souladu se sekvenčními methylačními kroky k mono-, di-a trimethylovým produktům. Plyn TMAs (III)by mohl být detekován na filtrech impregnovaných H2O2 oxidací na TMAs (V) O (viz obr. S1B v doplňkovém materiálu). Tyto výsledky ukazují, že čištěný CrArsM katalyzuje tři sekvenční kola methylace As (III) a přeměňuje toxický anorganický arsen na méně toxické nebo netoxické organické arseniky.
C. reinhardtii arsM genu za kanamycin propagátorem byl integrován do chromosomu P. putida KT2440, který nemá arsM gen a není methylate arsenu. Minitransposon dodávající plazmid pBAM1 byl použit jako sebevražedný vektor pro generování stabilních integrantů, které by mohly konstitutivně exprimovat arsM. Gen arsM byl klonován do pBAM1 (viz obr. S2, doplňkový materiál) a následně převedeny z Escherichia coli CC118λpir P. putida KT2440 o tripartitní konjugace s pomocníkem napětí. Divoký typ P. putida má dva chromozomální operony arsRBCH a může růst v přítomnosti 2 mM As (III), což poskytuje konkurenční výhodu P.putida v kontaminované půdě (10). To by mohlo být rozhodujícím faktorem pro udržení růstu buněk v přítomnosti domorodých bakteriálních populací (14). Buňky P. putida kt2440 exprimující CrArsM byly rezistentní na 7,5 až 10 mM jako (III)v kapalném bazální soli M9 média (obr. 1). Biotransformace arsenu buňkami byla testována s 25 µM As (III)nebo arsenátem (obr. 2). Po 12 hodinách se p. putida biomethyluje jako (III) primárně na DMAs (V)a v menší míře methylarsenát (obr. 2A). V době, závislé na módě, upravené buňky vyrábí dimethylarsine a TMAs(III) plyny, které lze identifikovat podle oxidační jim Dma(V) a TMAs(V)O s H2O2 (Obr. 2B). Kromě toho byl produkt methylační reakce kvantifikován v buňkách P. putidy exprimující CrArsM. Po 48 h, hlavní produkt našel v kultivačním médiu byl Dma(V) (57% z celkového obsahu arsenu), s menším množstvím MAs(V) (31%) a ještě méně TMAs(V), O (8%) (Obr. 2C). Transgenní kmen P. putida se rychle methyloval jako(V) (obr. 2A, křivka 4). V chromozomu P jsou dva arsrcbh operony. putida, takže je rozumné předpokládat, chromozomálně kódované ArsC reduktázy rychle sníží As(V) na As(III), substrátu CrArsM, což umožňuje půdní bakterie, aby methylate i Jako(V) a As(III).