TEKST
Arsen er et klasse i humant karsinogen som utgjør en helserisiko for mennesker. Arsen eksponering er knyttet til hudkreft, blærekreft, diabetes, kardiovaskulær sykdom og perifer vaskulær sykdom (1, 2). Us Environmental Protection Agency (EPA) rangerer arsen først på Sin Superfund Liste Over Farlige Stoffer (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
Arsen slippes ut i miljøet ved geotermisk aktivitet, ved oppløsning av mineraler og ved menneskeskapte aktiviteter som industriavløp, forbrenning av fossile brensler og bruk av arsenholdige plantevernmidler, herbicider, trebeskyttelsesmidler og tilsetningsstoffer (3). Som et resultat av bruken av arsen-forurenset vanningsvann, akkumuleres arsen i ris, kostholdsstiften for halvparten av verdens befolkning (4). Arsen metylering er en avgiftningsvei (5, 6). Mange organismer har gener som koder for arsenitt s-adenosylmetionin (SAM) metyltransferaser (betegnet ArsM i mikrober og AS3MT i høyere organismer) som biotransformerer Som (III) til metylerte arter, med flyktig ikke-toksisk trimetylarsin (7) som sluttprodukt (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida er En Gramnegativ bakterie som finnes i vann og jord, spesielt i rhizosfæren med relativt høy befolkningstetthet (10). Denne mikroorganismen har blitt studert grundig som en modell for bionedbrytning av aromatiske forbindelser som naftalen (11) og styren (12, 13). Konvensjonelle reparasjonsmetoder, som jordutgravning etterfulgt av koagulasjonsfiltrering eller ionbytter, er dyre, forstyrrende og ikke mye brukt (14). Sphingomonas desiccabilis og Bacillus idriensis uttrykker arsM kan fjerne arsen fra forurenset jord, men uttrykk fra et plasmid begrenser deres nytte (15). Pseudomonas-arter har utsikter til rhizoremediering av organiske forbindelser (16), men har ikke blitt brukt til fjerning av arsen.
målet med denne studien var å konstruere En stamme Av P. putida KT2440 med potensial for fjerning av arsen fra forurenset jord. Vi brukte Chlamydomonas reinhardtii arsM-genet som koder For En ArsM orhologue (CrArsM). In vitro, renset CrArsM metylert Som (III) til en rekke arter (Se Fig. S1A i tilleggsmaterialet). Etter 7 h ble metylarsenitt og dimetylarsenat produsert i relativt like mengder. Etter 14 timer var produktet primært DMAs (V), med mindre mengder trimetylarsinoksid og Ingen MAs(III). Disse resultatene er konsistente med sekvensielle metyleringstrinn til mono -, di-og trimetylprodukter. Tmas (III) gass kunne detekteres PÅ H2O2-impregnerte filtre ved oksidasjon Til TMAs (V)O (Se Fig. S1B i tilleggsmaterialet). Disse resultatene viser at renset CrArsM katalyserer tre sekvensielle runder Av As (III) metylering og omdanner giftig uorganisk arsen til mindre giftige eller ikke-toksiske organiske arsenaler.
c. reinhardtii arsM-genet bak kanamycin-promotoren ble integrert i kromosomet Av P. putida KT2440, som ikke har et arsM-gen og ikke metylerer arsen. Minitransposon levering plasmid pBAM1 ble brukt som en selvmordsvektor for a generere stabile integranter som kunne uttrykke arsM konstitutivt. Arsm-genet ble klonet til pBAM1 (Se Fig. S2 i tilleggsmaterialet) og deretter overført Fra Escherichia coli Cc118λ Til P. putida KT2440 ved trepartskonjugering med hjelpestamme. Villtype P. putida har to kromosomale arsrbch-operoner og kan vokse i nærvær av 2 mM As (III), noe Som gir en konkurransefortrinn For P. putida i forurenset jord (10). Dette kan være en avgjørende faktor for å opprettholde vekst av celler i nærvær av innfødte bakteriepopulasjoner (14). Celler Av P. putida KT2440 uttrykker CrArsM var motstandsdyktig mot 7,5 til 10 mM Som(III)i flytende basal salt m9 medium (Fig. 1). Biotransformasjon av arsen fra cellene ble analysert med 25 µ As(III) Eller arsenat (Fig. 2). Etter 12 timer utviklet p. putida biometylert Som (III) primært Til DMAs (V) og i mindre grad metylarsenat (Fig. 2A). På en tidsavhengig måte produserte de konstruerte cellene dimetylarsin og TMAs(III) gasser, identifisert ved å oksidere dem Til DMAs(V) og TMAs (V)O MED H2O2 (Fig . 2B). I tillegg ble produktet av metyleringsreaksjonen kvantifisert i celler Av P. putida som uttrykker CrArsM. Etter 48 timer var hovedproduktet funnet I kulturmediet DMAs (V) (57% av total arsen), med mindre mengder MAs (V) (31%) og enda mindre TMAs (V) O (8%) (Fig. 2C). Den transgene p. putida-stammen raskt metylert Som (V) (Fig. 2a, kurve 4). Det er to arsRCBH operoner i kromosomet Av P. putida, så det er rimelig å anta kromosomalt kodet ArsC reduktase raskt redusert As (V) Til As (III), substratet Av CrArsM, slik at jordbakterien kan metylere Både As (V) og As(III).