TEXTE
L’arsenic est un cancérogène humain de classe I qui présente un risque pour la santé humaine. L’exposition à l’arsenic est liée au cancer de la peau, au cancer de la vessie, au diabète, aux maladies cardiovasculaires et aux maladies vasculaires périphériques (1, 2). L’Agence américaine de protection de l’environnement (EPA) classe l’arsenic au premier rang de sa Liste Superfund des substances dangereuses (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
L’arsenic est rejeté dans l’environnement par l’activité géothermique, par dissolution de minéraux et par des activités anthropiques telles que les effluents industriels, la combustion de combustibles fossiles et l’utilisation de pesticides, d’herbicides, de conservateurs du bois et d’additifs alimentaires contenant de l’arsenic (3). En raison de l’utilisation d’eau d’irrigation contaminée par l’arsenic, l’arsenic s’accumule dans le riz, aliment de base de la moitié de la population mondiale (4). La méthylation de l’arsenic est une voie de désintoxication (5, 6). De nombreux organismes ont des gènes codant pour l’arsénite S-adénosylméthionine (SAM) méthyltransférases (appelées ArsM dans les microbes et AS3MT dans les organismes supérieurs) qui biotransforment As(III) en espèces méthylées, avec de la triméthylarsine non toxique volatile (7) comme produit final (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida est une bactérie à Gram négatif présente dans l’eau et le sol, en particulier dans la rhizosphère à une densité de population relativement élevée (10). Ce microorganisme a été largement étudié comme modèle de biodégradation de composés aromatiques tels que le naphtalène (11) et le styrène (12, 13). Les méthodes d’assainissement classiques, telles que l’excavation du sol suivie d’une filtration par coagulation ou d’un échange d’ions, sont coûteuses, perturbatrices et peu utilisées (14). Sphingomonas desiccabilis et Bacillus idriensis exprimant l’arsM peuvent éliminer l’arsenic du sol contaminé, mais l’expression d’un plasmide limite leur utilité (15). Les espèces de Pseudomonas ont la possibilité de rhizoremédiation de composés organiques (16) mais n’ont pas été utilisées pour l’élimination de l’arsenic.
L’objectif de cette étude était de construire une souche de P. putida KT2440 avec le potentiel d’élimination de l’arsenic du sol contaminé. Nous avons utilisé le gène arsM de Chlamydomonas reinhardtii codant pour un orthologue ArsM (CrArsM). In vitro, le CrArsM purifié méthylé en As(III) à diverses espèces (voir Fig. S1A dans le matériel supplémentaire). Après 7 h, la méthylarsénite et le diméthylarsénate sont produits en quantités relativement égales. Après 14 h, le produit était principalement du DMAs(V), avec des quantités moindres d’oxyde de triméthylarsine et pas de MAs(III). Ces résultats concordent avec les étapes de méthylation séquentielle des produits mono-, di- et triméthyle. Le gaz TMAs(III) a pu être détecté sur des filtres imprégnés de H2O2 par oxydation en TMAs(V)O (voir Fig. S1B dans le matériel supplémentaire). Ces résultats démontrent que le CrArsM purifié catalyse trois cycles séquentiels de méthylation As(III) et convertit l’arsenic inorganique toxique en arsenic organiques moins toxiques ou non toxiques.
Le gène arsM de C. reinhardtii derrière le promoteur de la kanamycine a été intégré dans le chromosome de P. putida KT2440, qui n’a pas de gène arsM et ne méthyle pas l’arsenic. Le plasmide d’administration de Minitransposon pBAM1 a été utilisé comme vecteur de suicide pour générer des intégrants stables qui pourraient exprimer constitutivement l’arsM. Le gène arsM a été cloné en pBAM1 (voir Fig. S2 dans le matériel supplémentaire) et ensuite transféré d’Escherichia coli CC118λpir à P. putida KT2440 par conjugaison tripartite avec une souche auxiliaire. P. putida de type sauvage possède deux opérons arsRBCH chromosomiques et peut se développer en présence d’As(III) de 2 mM, ce qui offre un avantage concurrentiel à P. putida dans un sol contaminé (10). Cela pourrait être un facteur crucial pour maintenir la croissance des cellules en présence de populations bactériennes indigènes (14). Les cellules de P. putida KT2440 exprimant le CrArsM étaient résistantes de 7,5 à 10 mM As(III) en milieu de sel de base liquide M9 (Fig. 1). La biotransformation de l’arsenic par les cellules a été dosée avec 25 µM d’As(III) ou d’arséniate (Fig. 2). Après 12 h, P. putida a été biométhylé en As(III) principalement en DMAs (V) et, dans une moindre mesure, en méthylarsénate (Fig. 2 BIS). En fonction du temps, les cellules modifiées ont produit de la diméthylarsine et des gaz TMAs(III), identifiés en les oxydant en DMAs(V) et TMAs(V)O avec H2O2 (Fig. 2B). De plus, le produit de la réaction de méthylation a été quantifié dans des cellules de P. putida exprimant le CrArsM. Après 48 h, le produit majeur trouvé dans le milieu de culture était le DMAs(V) (57% de l’arsenic total), avec des quantités moindres de MAs(V) (31%) et encore moins de TMAs(V)O (8%) (Fig. 2C). La souche transgénique de P. putida s’est rapidement méthylée en (V) (Fig. 2A, courbe 4). Il y a deux opérons arsRCBH dans le chromosome de P. putida, il est donc raisonnable de supposer que la réductase ArsC codée sur le chromosome a rapidement réduit As(V) en As (III), le substrat du CrArsM, permettant à la bactérie du sol de se méthyler à la fois As(V) et As(III).