tekst
arsen er et klasse i humant kræftfremkaldende stof, der udgør en sundhedsrisiko for mennesker. Arseneksponering er forbundet med hudkræft, blærekræft, diabetes, hjerte-kar-sygdom og perifer vaskulær sygdom (1, 2). US Environmental Protection Agency (EPA) rangerer arsen først på sin Superfund liste over farlige stoffer (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arsen frigives i miljøet ved geotermisk aktivitet, ved opløsning af mineraler og ved menneskeskabte aktiviteter såsom industrielt spildevand, forbrænding af fossile brændstoffer og anvendelse af arsenholdige pesticider, herbicider, træbeskyttelsesmidler og fodertilsætningsstoffer (3). Som et resultat af brugen af arsen-forurenet vandingsvand akkumuleres arsen i ris, diætstiften for halvdelen af verdens befolkning (4). Arsenmethylering er en afgiftningsvej (5, 6). Mange organismer har gener, der koder for arsenit S-adenosylmethionin (SAM) methyltransferaser (betegnet ArsM i mikrober og AS3MT i højere organismer), der biotransformerer As(III) til methylerede arter med flygtig ikke-toksisk trimethylarsin (7) som slutprodukt (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida er en gramnegativ bakterie, der findes i vand og jord, især i jordstænglen ved en relativt høj befolkningstæthed (10). Denne mikroorganisme er blevet undersøgt grundigt som en model til bionedbrydning af aromatiske forbindelser såsom naphthalen (11) og styren (12, 13). Konventionelle oprensningsmetoder, såsom jordudgravning efterfulgt af koagulationsfiltrering eller ionbytning, er dyre, forstyrrende og ikke udbredt (14). Sphingomonas desiccabilis og Bacillus idriensis, der udtrykker arsM, kan fjerne arsen fra forurenet jord, men ekspression fra et plasmid begrænser deres anvendelighed (15). Pseudomonas arter har udsigt til jordstænglermediering af organiske forbindelser (16), men er ikke blevet brugt til arsenfjernelse.
formålet med denne undersøgelse var at konstruere en stamme af P. putida KT2440 med potentiale for fjernelse af arsen fra forurenet jord. Vi brugte Chlamydomonas reinhardtii arsM-genet, der koder for en ArsM-ortolog (CrArsM). In vitro, oprenset CrArsM methyleret som (III) til en række arter (Se Fig. S1A i det supplerende materiale). Efter 7 timer blev methylarsenit og dimethylarsenat produceret i relativt lige store mængder. Efter 14 timer var produktet primært DMA ‘ er(V) med mindre mængder trimethylarsin og ingen MAs (III). Disse resultater er i overensstemmelse med sekventielle methyleringstrin til mono-, di-og trimethylprodukterne. TMA ‘er(III) gas kunne detekteres på H2O2-imprægnerede filtre ved iltning til TMA’ er (V)O (se Fig. S1B i det supplerende materiale). Disse resultater viser, at oprenset CrArsM katalyserer tre sekventielle runder af AS(III) methylering og omdanner toksisk uorganisk arsen til mindre giftige eller ikke-toksiske organiske arsenikstoffer.
C. reinhardtii arsM-genet bag kanamycinpromotoren blev integreret i kromosomet af P. putida KT2440, som ikke har et arsM-gen og ikke methylerer arsen. Minitransposon-leveringsplasmid pBAM1 blev brugt som en selvmordsvektor til at generere stabile integranter, der kunne udtrykke arsM konstitutivt. ArsM-genet blev klonet til pBAM1 (se Fig. S2 i det supplerende materiale) og efterfølgende overført fra Escherichia coli Cc118 Larpir til P. putida KT2440 ved treparts konjugation med en hjælperstamme. Vildtype P. putida har to kromosomale arsRBCH operoner og kan vokse i nærvær af 2 mM As(III), hvilket giver en konkurrencemæssig fordel for P. putida i forurenet jord (10). Dette kan være en afgørende faktor for at opretholde vækst af celler i nærvær af indfødte bakteriepopulationer (14). Celler af P. putida KT2440, der udtrykker CrArsM, var resistente over for 7,5 til 10 mM som(III) i flydende basalsalt M9-medium (Fig. 1). Biotransformation af arsen af cellerne blev analyseret med 25 liter som (III) eller arsenat (Fig. 2). Efter 12 timer, konstrueret P. putida biomethyleret som(III) primært til DMA ‘ er (V) og i mindre grad methylarsenat (Fig. 2A). På en tidsafhængig måde producerede de konstruerede celler dimethylarsin-og TMA ‘er(III) gasser, identificeret ved at ilte dem til DMA’ er(V) og TMA ‘ er(V)O med H2O2 (Fig. 2B). Derudover blev produktet af methyleringsreaktionen kvantificeret i celler af P. putida, der udtrykker CrArsM. Efter 48 timer var det vigtigste produkt, der blev fundet i dyrkningsmediet, DMA ‘er(V) (57% af det samlede arsen) med mindre mængder MAs(V) (31%) og endnu mindre TMA’ er(V)O (8%) (Fig. 2C). Den transgene P. putida-stamme methyleres hurtigt som (V) (Fig. 2A, kurve 4). Der er to arsrcbh operoner i kromosomet af P. putida, så det er rimeligt at antage, at den kromosomalt kodede ArsC-reduktase hurtigt reduceres som(V) til As(III), substratet for CrArsM, hvilket tillader jordbakterien at methylere både som(V) og As(III).