teksti
arseeni on luokan I karsinogeeni, joka aiheuttaa terveysriskin ihmisille. Arseenialtistus on yhteydessä ihosyöpään, virtsarakon syöpään, diabetekseen, sydän-ja verisuonitauteihin ja ääreisverisuonitautiin (1, 2). Yhdysvaltain ympäristönsuojeluvirasto EPA pitää arseenia ensimmäisenä Superfund-vaarallisten aineiden listallaan (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arseenia vapautuu ympäristöön geotermisen toiminnan, mineraalien liuottamisen ja ihmisen toiminnan, kuten teollisten jätevesien, fossiilisten polttoaineiden palamisen sekä arseenia sisältävien torjunta-aineiden, rikkakasvien torjunta-aineiden, puunsuoja-aineiden ja rehun lisäaineiden (3) avulla. Arseenin saastuttaman kasteluveden käytön seurauksena arseenia kertyy riisiin, joka on ravinnon perusaines puolelle maailman väestöstä (4). Arseenimetylaatio on detoksikaatioreitti (5, 6). Monilla organismeilla on geenejä, jotka koodaavat arseniitti S-adenosyylimetioniini (SAM) metyylitransferaaseja (kutsutaan arsm mikrobeissa ja as3mt korkeammissa organismeissa), jotka biotransformoituvat (III) metyloituneiksi lajeiksi, ja lopputuotteena on haihtuva myrkytön trimetyyliarsiini (7) (5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida on gramnegatiivinen bakteeri, jota esiintyy vedessä ja maaperässä, erityisesti rhizosfäärissä suhteellisen tiheässä populaatiossa (10). Tätä mikro-organismia on tutkittu laajasti aromaattisten yhdisteiden, kuten naftaleenin (11) ja styreenin (12, 13) biohajoamisen mallina. Perinteiset kunnostusmenetelmät, kuten maaperän kaivaminen, jota seuraa koagulaatiosuodatus tai ioninvaihto, ovat kalliita, häiritseviä eikä niitä käytetä laajalti (14). Sphingomonas desiccabilis ja Bacillus idriensis ilmentävät arsM: ää voivat poistaa arseenia saastuneesta maaperästä, mutta ilmentyminen plasmidista rajoittaa niiden hyödyllisyyttä (15). Pseudomonas-lajeilla on mahdollisuus orgaanisten yhdisteiden rhizoremediatioon (16), mutta niitä ei ole käytetty arseenin poistoon.
tämän tutkimuksen tavoitteena oli rakentaa P. putida KT2440, joka saattaa poistaa arseenia saastuneesta maaperästä. Käytimme Klamydomonas reinhardtii arsM-geeniä, joka koodaa Arsm-ortologiaa (CrArsM). In vitro, puhdistettu Krarsm metyloitu (III)eri lajeille (KS. S1A lisämateriaalissa). 7 tunnin kuluttua metyyliarseniittia ja dimetyyliarsenaattia valmistettiin suhteellisen yhtä paljon. 14 tunnin kuluttua tuotteena oli pääasiassa DMAs (V), jossa oli vähemmän trimetyyliarsiinioksidia eikä mas(III): a. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia mono-, di-ja trimetyylituotteiden peräkkäisten metylaatiovaiheiden kanssa. Tmas(III)-kaasua voitiin havaita H2O2-kyllästetyissä suodattimissa hapettumalla tmas (V)O: ksi (KS. S1B lisämateriaalissa). Nämä tulokset osoittavat, että puhdistettu Krarsm katalysoi kolmea peräkkäistä as(III) – metylaatiokierrosta ja muuntaa myrkyllisen epäorgaanisen arseenin vähemmän myrkyllisiksi tai myrkyttömiksi orgaanisiksi arsenikeiksi.
kanamysiinin promoottorin takana oleva C. reinhardtii arsM-geeni integroitui P. putidan kt2440-kromosomiin, jossa ei ole arsM-geeniä eikä metyloi arseenia. Minitransposonin toimitus plasmidi pBAM1: tä käytettiin itsemurhavektorina tuottamaan stabiileja integrantteja, jotka voisivat ilmaista arsm: ää konstitutiivisesti. ArsM-geeni kloonattiin pbam1: ksi (KS. S2 lisämateriaalissa) ja sen jälkeen siirretty Escherichia coli CC118λpir-bakteerista P. putida KT2440-bakteeriin kolmikantakonjugaatiolla auttajakannan kanssa. Villityyppisellä P. putidalla on kaksi kromosomaalista arsRBCH-operonia ja se voi kasvaa 2 mM: n läsnä ollessa(III), mikä antaa kilpailuedun P. putidalle saastuneessa maaperässä (10). Tämä voi olla ratkaiseva tekijä solujen kasvun ylläpitämisessä kotoperäisten bakteeripopulaatioiden läsnä ollessa (14). P. putida KT2440: n crarsmia ilmentävät solut olivat resistenttejä 7, 5-10 mM: lle(III) nestemäisessä perussuola M9-väliaineessa (Kuva. 1). Solujen suorittama arseenin biotransformaatio määritettiin 25 µM: lla(III) tai arsenaatilla (Fig. 2). 12 tunnin kuluttua valmistettu P. putida biometyloitiin (III) ensisijaisesti DMAs: ksi(V) ja vähäisemmässä määrin metyyliarsenaatiksi (Fig. 2 A). Rakennetut solut tuottivat ajasta riippuvaisesti dimetyyliarsiinia ja TMAs(III) – kaasuja, jotka tunnistettiin hapettamalla ne DMAs(V): ksi ja TMAs(V)O: ksi H2O2: lla (Fig. 2b). Lisäksi metylaatioreaktion tuote kvantifioitiin Krarsmia ilmentävän P. putidan soluissa. 48 tunnin kuluttua tärkein viljelyaineesta löydetty tuote oli DMAs (V) (57% arseenin kokonaismäärästä), vähemmän mas (V) (31%) Ja vielä vähemmän TMAs (V) O (8%) (Fig. 2C). Siirtogeeninen P. putida-kanta metyloitui nopeasti(V) (Kuva. 2A, käyrä 4). P: n kromosomissa on kaksi arsRCBH-operonia. putida, joten on kohtuullista olettaa, että kromosomaalisesti koodattu ArsC-reduktaasi pienenee nopeasti Crarsmin substraattina(V) as(III): ksi, jolloin maabakteeri voi metyloitua sekä as(V) että As(III).