TEXT
arsenicul este un agent cancerigen uman de clasa I care prezintă un risc pentru sănătate pentru oameni. Expunerea la Arsenic este legată de cancerul de piele, cancerul vezicii urinare, diabetul, bolile cardiovasculare și bolile vasculare periferice (1, 2). Agenția SUA pentru Protecția Mediului (EPA) clasează arsenicul pe primul loc pe lista Superfundelor de substanțe periculoase (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arsenicul este eliberat în mediu prin activitatea geotermală, prin dizolvarea mineralelor și prin activități antropice, cum ar fi efluenții industriali, arderea combustibililor fosili și utilizarea pesticidelor, erbicidelor, conservanților lemnului și aditivilor furajeri care conțin arsenic (3). Ca urmare a utilizării apei de irigare contaminate cu arsenic, arsenicul se acumulează în orez, baza dietetică pentru jumătate din populația lumii (4). Metilarea arsenicului este o cale de detoxifiere (5, 6). Multe organisme au gene care codifică arsenitul s-adenozilmetionină (SAM) metiltransferaze (denumite ArsM în microbi și AS3MT în organismele superioare) care biotransformă As (III) în specii metilate, cu trimetilarsină netoxică volatilă (7) ca produs final(5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida este o bacterie Gram-negativă Găsită în apă și sol, în special în rizosferă la o densitate relativ mare a populației (10). Acest microorganism a fost studiat extensiv ca model pentru biodegradarea compușilor aromatici precum naftalina (11) și stirenul (12, 13). Metodele convenționale de remediere, cum ar fi excavarea solului urmată de filtrarea coagulării sau schimbul de ioni, sunt costisitoare, perturbatoare și nu sunt utilizate pe scară largă (14). Sphingomonas desiccabilis și Bacillus idriensis care exprimă arsM pot elimina arsenicul din solul contaminat, dar expresia dintr-o plasmidă le limitează utilitatea (15). Speciile de Pseudomonas au perspectiva rhizoremedierii compușilor organici (16), dar nu au fost utilizate pentru îndepărtarea arsenicului.
Obiectivul acestui studiu a fost de a construi o tulpină de P. putida KT2440 cu potențial de îndepărtare a arsenicului din solul contaminat. Am folosit Gena Chlamydomonas reinhardtii arsM care codifică un ortolog ArsM (CrArsM). In vitro, CrArsM purificat metilat As (III) la o varietate de specii (vezi Fig. S1A în materialul suplimentar). După 7 ore, metilarsenitul și dimetilarsenatul au fost produse în cantități relativ egale. După 14 ore, produsul a fost în principal DMAs(V), cu cantități mai mici de oxid de trimetilarsină și fără MAs (III). Aceste rezultate sunt în concordanță cu etapele secvențiale de metilare la produsele mono-, di-și Trimetil. Gazul TMA (III)poate fi detectat pe filtrele impregnate cu H2O2 prin oxidare la TMA(V) O (vezi Fig. S1B în materialul suplimentar). Aceste rezultate demonstrează că CrArsM purificat catalizează trei runde secvențiale de metilare As(III) și transformă arsenicul anorganic toxic în arsenici organici mai puțin toxici sau netoxici.
gena C. reinhardtii arsM din spatele promotorului kanamicinei a fost integrată în cromozomul P. putida KT2440, care nu are o genă arsM și nu metilează arsenic. Plasmida de livrare Minitransposon pBAM1 a fost utilizată ca vector de sinucidere pentru a genera integranți stabili care ar putea exprima arsM constitutiv. Gena arsM a fost clonată în pBAM1 (vezi Fig. S2 în materialul suplimentar) și ulterior transferat de la Escherichia coli Cc118 la P. putida KT2440 prin conjugare tripartită cu o tulpină ajutătoare. P. putida de tip sălbatic are doi operoni arsrbch cromozomiali și poate crește în prezența a 2 mm As(III), ceea ce oferă un avantaj competitiv P. putida în solul contaminat (10). Acesta ar putea fi un factor crucial pentru susținerea creșterii celulelor în prezența populațiilor bacteriene indigene (14). Celulele P. putida KT2440 care exprimă CrArsM au fost rezistente la 7,5 până la 10 mm As(III) în mediu lichid de sare bazală M9 (Fig. 1). Biotransformarea arsenicului de către celule a fost testată cu 25 de centimili As(III) sau arsenat (Fig. 2). După 12 ore, prin inginerie P. putida biometilat As (III) în principal în DMAs(V) și, într-o măsură mai mică, metilarsenat (Fig. 2A). Într-o manieră dependentă de timp, celulele proiectate au produs dimetilarsină și TMA(III) gaze, identificate prin oxidarea lor în DMAs(V) și TMA(V)O cu H2O2 (Fig. 2B). În plus, produsul reacției de metilare a fost cuantificat în celulele P. putida care exprimă CrArsM. După 48 de ore, produsul principal găsit în mediul de cultură a fost DMAs (V) (57% Din arsenicul total), cu cantități mai mici de MAs (V) (31%) și chiar mai puțin TMAs (V)O (8%) (Fig. 2C). Tulpina transgenică P. putida s-a metilat rapid ca(V) (Fig. 2A, curba 4). Există doi operoni arsRCBH în cromozomul P. putida, deci este rezonabil să presupunem că ArsC reductaza codificată cromozomial s-a redus rapid ca(V) la As(III), substratul CrArsM, permițând bacteriei solului să metileze atât As(V), cât și AS(III).