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El arsénico es un carcinógeno humano de clase I que representa un riesgo para la salud de los seres humanos. La exposición al arsénico está relacionada con el cáncer de piel, el cáncer de vejiga, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades vasculares periféricas (1, 2). La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés) clasifica al arsénico en el primer lugar de su Lista de Sustancias Peligrosas del Superfondo (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
El arsénico se libera al medio ambiente por la actividad geotérmica, la disolución de minerales y las actividades antropogénicas, como los efluentes industriales, la combustión de combustibles fósiles y el uso de pesticidas, herbicidas, conservantes de madera y aditivos para piensos que contienen arsénico (3). Como resultado del uso de agua de riego contaminada con arsénico, el arsénico se acumula en el arroz, el alimento básico de la mitad de la población mundial (4). La metilación de arsénico es una vía de desintoxicación (5, 6). Muchos organismos tienen genes que codifican las metiltransferasas de arsenito S-adenosilmetionina (SAM) (denominadas ArsM en microbios y AS3MT en organismos superiores) que se biotransforman como (III) en especies metiladas, con trimetilarsina no tóxica volátil (7) como producto final(5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida es una bacteria gramnegativa que se encuentra en el agua y el suelo, particularmente en la rizosfera con una densidad de población relativamente alta (10). Este microorganismo ha sido ampliamente estudiado como modelo para la biodegradación de compuestos aromáticos como naftaleno (11) y estireno (12, 13). Los métodos de remediación convencionales, como la excavación del suelo seguida de filtración por coagulación o intercambio iónico, son costosos, perturbadores y no se utilizan ampliamente (14). Sphingomonas desiccabilis y Bacillus idriensis que expresan arsM pueden eliminar arsénico del suelo contaminado, pero la expresión de un plásmido limita su utilidad (15). Las especies de Pseudomonas tienen la posibilidad de rizorremediación de compuestos orgánicos (16), pero no se han utilizado para eliminar el arsénico.
El objetivo de este estudio fue construir una cepa de P. putida KT2440 con potencial de eliminación de arsénico de suelos contaminados. Utilizamos el gen ARSM de Chlamydomonas reinhardtii que codifica un ortólogo ArsM (CrArsM). CrArsM purificado metilado in vitro como(III) a una variedad de especies (ver Fig. S1A en el material suplementario). Después de 7 h, se produjeron metilarsenita y dimetilarsenato en cantidades relativamente iguales. Después de 14 h, el producto fue principalmente DMAs(V), con cantidades menores de óxido de trimetilarsina y sin MAs(III). Estos resultados son consistentes con los pasos secuenciales de metilación de los productos mono, di y trimetil. El gas TMAs (III)podría detectarse en filtros impregnados con H2O2 por oxidación a TMAs(V) O (véase la Fig. S1B en el material suplementario). Estos resultados demuestran que el CrArsM purificado cataliza tres rondas secuenciales de metilación de As(III) y convierte arsénico inorgánico tóxico en arsenicales orgánicos menos tóxicos o no tóxicos.
El gen arsM de C. reinhardtii detrás del promotor de kanamicina se integró en el cromosoma de P. putida KT2440, que no tiene un gen arsM y no metila arsénico. El plásmido de liberación de minitransposones pBAM1 se utilizó como vector suicida para generar integrantes estables que pudieran expresar constitutivamente el arsM. El gen arsM fue clonado en pBAM1 (ver Fig. S2 en el material suplementario) y posteriormente transferido de Escherichia coli CC118λpir a P. putida KT2440 mediante conjugación tripartita con una cepa auxiliar. P. putida de tipo silvestre tiene dos operones cromosómicos de arsRBCH y puede crecer en presencia de 2 mm de As (III), lo que proporciona una ventaja competitiva a P. putida en suelos contaminados (10). Esto podría ser un factor crucial para mantener el crecimiento de células en presencia de poblaciones bacterianas autóctonas (14). Las células de P. putida KT2440 que expresaban CrArsM eran resistentes a 7,5 a 10 mm Como(III) en medio salino basal líquido M9 (Fig. 1). La biotransformación de arsénico por las células se analizó con 25 µM como(III) o arseniato (Fig. 2). Después de 12 h, P. putida se biometiló como(III) principalmente a DMAs(V) y, en menor grado, metilarsenato (Fig. 2A). De manera dependiente del tiempo, las células diseñadas produjeron dimetilarsina y gases TMAs (III), identificados oxidándolos a DMAs(V)y TMAs(V) O con H2O2 (Fig. 2B). Además, el producto de la reacción de metilación se cuantificó en células de P. putida que expresaban CrArsM. Después de 48 h, el producto principal encontrado en el medio de cultivo fue DMAs(V) (57% del arsénico total), con cantidades menores de MAs(V) (31%) e incluso menos TMAs(V)O (8%) (Fig. 2C). La cepa transgénica de P. putida se metiló rápidamente como (V) (Fig. 2A, curva 4). Hay dos operones arsRCBH en el cromosoma de P. putida, por lo que es razonable suponer que la reductasa ArsC codificada cromosómicamente se reduce rápidamente Como(V) a Como(III), el sustrato del CrArsM, permitiendo que la bacteria del suelo se metile tanto como(V) como(III).