Epstein-Barr Virus- (EBV-) udødelige Lymfoblastoide cellelinjer (Lcl ‘ er) udtrykker højt niveau af CD23, men lavt CD27 for at understøtte deres vækst

abstrakt

Epstein-Barr virus (EBV) er en af de almindelige humane herpesvirustyper i verden. EBV er kendt for at inficere mere end 95% af voksne i verden. Virussen inficerer hovedsageligt B-lymfocytter og kan udødeliggøre og omdanne cellerne til EBV-bærende lymfoblastoide cellelinjer (Lcl ‘ er). Begrænsede undersøgelser har været fokuseret på at karakterisere overflademarkørekspression af de udødelige Lcl ‘ er. Denne undersøgelse demonstrerer genereringen af 15 Lcl ‘ er fra seksten patienter med reumatoid arthritis (RA) og en sund frivillig, der bruger B95-8 marmoset-afledt EBV. Succesraten for LCL-generation var 88,23%. Alle CD19 + Lcl ‘ er udtrykte CD23 (16,94-58,9%) og CD27 (15,74-80,89%) på celleoverfladen. Vores data viste to forskellige kategorier af LCL ‘er (hurtigt og langsomt voksende) (p<0.05) baseret på deres fordoblingstid. De langsomt voksende Lcl ‘er viste lavere CD23-niveau (35,28%) sammenlignet med hurtigt voksende Lcl’ er (42,39%). I modsætning hertil viste de langsomt voksende Lcl ‘ er højere procentdel i både CD27 alene og CD23+CD27+ i kombination. Samlet set kan disse fund antyde korrelationer af cellulær CD23-og CD27-ekspression med proliferationshastigheden for de genererede Lcl ‘ er. Forøg ekspression af CD23 kan spille en rolle i EBV-udødeliggørelse af B-celler og vækst og vedligeholdelse af de EBV-transformerede Lcl ‘ er, mens CD27-ekspression kan have hæmmende virkninger på LCL-proliferation. Yderligere undersøgelser er berettiget til disse spekulationer.

1. Introduktion

Epstein-Barr virus (EBV) har inficeret mere end 95% voksne globalt . EBV målretter og inficerer hovedsageligt B-celler efterfulgt af epitelceller og i mindre grad CD4 T-celler . Infektiøse virioner produceres efter den lytiske replikation i B-celler og epitelceller. Efter den lytiske cyklus følger EBV-latenstid og vedvarer i de inficerede B-celler resten af individets liv . EBV forårsager hovedsageligt infektiøs mononukleose, og det er også tæt forbundet med både lymfoide og epiteliale maligniteter såsom Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom, nasopharyngeal carcinoma og gastrisk kræft .

EBV inficerer B-celler og kan udødeliggøre B-cellerne og danne langsigtede voksende Lcl ‘ er, som konsekvent udtrykker virusserne . Denne metode er blevet brugt i laboratorier til at udødeliggøre visse humane blodafledte B-celler, som senere kan bruges som en kulturmodel til forskellige undersøgelser, herunder storstilet lægemiddelbiblioteksscreening, vaccineundersøgelse og biologiske undersøgelser med høj kapacitet . Blandt alle synes EBV produceret fra B95-8, en marmoset cellelinie, at være den mest almindelige og potente EBV kilde til B-celle udødeliggørelse. I de sidste årtier har forskere gjort en indsats for at forbedre udødeliggørelsesmetoden og dens effektivitet . For nylig har det vist sig, at Lcl ‘ er med en mindre modifikation kunne genereres fra et lille volumen perifert blod så lavt som 0,1 mL . Dette fund er særlig nyttigt under en omstændighed, hvor prøvevolumenet er begrænset.

tidligere undersøgelser har rapporteret, at immunceller, især B-celler og deres undergrupper, spiller en central rolle i patogenesen af RA . På trods af succesen med EBV-udødeliggørelse af B-celler er der ikke gjort meget om karakteriseringen af LCL ‘ er og dens sammenligning med forældrenes B-celler. I denne undersøgelse viste vi, at EBV effektivt kunne udødeliggøre B-celler fra RA-patienters perifere blod og danne Lcl’ er. Vi undersøgte derefter ekspressionsniveauerne for flere B-celler underpopulationsmarkører inklusive CD23 og CD27 i både Lcl ‘ er og deres forældres B-celler. Disse B-celle subpopulationer har tidligere været forbundet med den kliniske præsentation af RA-patienter. For eksempel er forhøjede B-celler, der udtrykker CD23, blevet påvist hos RA-patienter, og de kunne blokeres af monoklonale antistoffer . Tilsvarende blev øget mængde CD27 + IgD-hukommelse B-celler også let påvist hos patienter med aktiv RA . På den anden side demonstrerede Hu og kolleger, at CD27+ B-celler negativt korrelerede med sygdomsaktiviteten af RA og viste sig at være nedsat hos patienterne .

i denne undersøgelse forsøgte vi at evaluere ekspressionsniveauet for CD23 og/eller CD27 af B-celler fra Pbmc ‘er og LCL’ er afledt af RA-patienter. Vi undersøgte også ekspressionsniveauet for CD23 og CD27 med hensyn til den cellulære vækst af LCL ‘ er.

2. Materialer og metoder

2.1. Patientprøver

5 ml perifert blod fra seksten RA-patienter (tabel 1) blev opsamlet fra Sunshine Medical Center, Malaysia, under en etisk godkendelseskode af 011/2017/ER. Pbmc ‘ er blev isoleret ved hjælp af GE Healthcare-metoden. Kort fortalt blev blodet opsamlet i EDTA-røret fortyndet 1 til 1 med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) og lagdelt på Ficoll-Pakeopløsningen i et frisk centrifugerør. Røret blev centrifugeret ved 400 Hg i 40 minutter ved stuetemperatur med lav acceleration og ‘bremse off ‘. Det øverste lag, som er plasmaet, blev opsamlet og aciteret inden opbevaring ved -80 liter C. buffy coat indeholdende Pbmc ‘ er blev opsamlet ved hjælp af 3 ml Pasteur-pipette og overført til et frisk centrifugerør. Cellerne blev vasket to gange med PBS efterfulgt af RPMI-medium indeholdende 10% føtal bovint Serum (FBS), før kryokonserveret i 10% DMSO og opbevaret i flydende nitrogenlagertank. 5 ml blod blev doneret fra en sund frivillig som kontrol. Pbmc ‘ erne og plasmaet blev behandlet og opbevaret som beskrevet ovenfor. Datoen for diagnose, blodprøveudtagning, pbmc ‘ er kryopræservering og EBV-udødeliggørelse er vist i supplerende materialer (tilgængelig her).

2.2. Blodprøve og beregning af sygdomsaktivitet

2.3. EBV Udødeliggørelse

B95-8 marmoset-afledt EBV supernatant var en venlig gave fra Dr. Alan Soo-Beng Khoo, Molecular Pathology unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia. B-celler fra patientens perifere blod blev udødeliggjort under anvendelse af den koncentrerede EBV-supernatant som tidligere beskrevet . Tabellen i supplerende materialer viser datoen for pbmc-isolering og kryopræservering, lcls-etablering, og varigheden af kryopræserverede Pbmc ‘ er opbevaret i lagertank med flydende nitrogen. Kort fortalt blev et hætteglas med tidligere kryokonserveret PBMC optøet, og celletallet blev bestemt. Cellerne blev justeret til 2 gange 106 / mL under anvendelse af frisk optøet EBV-supernatant og inkuberet natten over ved 37 kg C, 5% CO2 i en stående T25-kolbe. Den næste dag blev transformationsmedium (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml cyclosporin) tilsat i kolben. De EBV-inficerede celler blev observeret under mikroskopet for at se efter rosetlignende transformerede Lcl ‘ er i klynger. Lcl ‘ er i passager 3-6 blev anvendt til strømningscytometrianalysen og celleproliferationsanalysen.

2.4. Analyse af strømningscytometri

trefarvet cytometri blev udført på FACSCalibur-strømningscytometer (Becton Dickinson) ved anvendelse af monoklonale antistoffer, der identificerer overfladeantigener for T-celler (CD3/PE, klon SK7), B-celler (CD19/BB515, HIB19) og B-celle-undergrupper (CD23/APC, klon EBV-CS5 og CD27/PE, klon L128). Cellelevedygtighedsløsning 7aad (VIA-PROBE) blev købt for at bestemme cellelevedygtigheden. Alle antistoffer blev købt fra Becton Dickinson. Kort fortalt blev kryokonserverede Pbmc ‘ er optøet og resuspenderet i 50 liter BSA-pletbuffer (Becton Dickinson) og inkuberet ved stuetemperatur i mørke med forudfortyndede fluorochrom-konjugerede antistoffer i 30 minutter. Pbmc ‘ erne blev derefter vasket to gange med BSA-pletbuffer og resuspenderet i 500 liter BSA-buffer til strømningscytometrianalyse. Kontrol PBMC-suspensioner blev fremstillet med samme procedure. 20.000 levedygtige celler bestemt af cellelevedygtighedsfarvestoffet blev lukket og opsamlet til trefarveanalyse i sæt CD3/CD19/CD23 og CD19/CD27/CD23. Data blev analyseret ved hjælp af Becton Dickinson.

2.5. Lcls Proliferation Assay

for at adskille LCLs i to kategorier (hurtigt og langsomt voksende) blev celleproliferationshastigheden bestemt ved hjælp af Realtime – Glo MT cell levedygtighed assay (Promega) efter producentens instruktion. Dette er et nonlytisk luminescensbaseret assay, der kan registrere proliferation i realtid af levende celler i kultur op til 72 timer. Kort fortalt blev 10.000 celler/brønd podet på en hvid fladbundet 96-brøndplade (Greiner Bio-one) i tre eksemplarer. 2 gange reaktionsblanding blev fremstillet ud fra det medfølgende kit og tilsat til hver brønd. Celler blev inkuberet ved 37 liter C, 5% CO2 i 1 time før målingen blev taget på forskellige tidspunkter (0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, 72 timer) ved hjælp af en luminescens mikropladelæser (Tecan). De relative luminescensenheder (RLU ‘er) versus tidsgraf blev afbildet for at vise vækstkurven for LCL’ erne. I denne Graf blev cellenummeret repræsenteret af RLU ‘ erne. Ved hjælp af RLU ‘erne blev fordoblingstiden (den tid, der kræves for, at et celletal fordobles i værdi) for hver kategori af LCL’ er beregnet ved hjælp af en multipoint online-regnemaskine, der blev brugt til signifikanstest . Dette onlineværktøj bruger den mindste kvadraters passende eksponentielle metode til at beregne fordoblingstiden . Vækstraten (antal fordoblinger, der forekommer pr.tidsenhed) blev derefter beregnet ved hjælp af nedenstående formel:middelværdien af alle LCL’ ers fordoblingstid var 54,69 timer. Derfor blev denne værdi brugt som cutoff og LCL ‘ er med fordoblingstid højere end 54.69 timer blev grupperet i langsomt voksende Lcl ‘er og omvendt for hurtigt voksende Lcl’ er.

2.6. Statistisk analyse

strømningscytometrianalyse blev udført i tre uafhængige eksperimenter for hver kategori af LCL ‘ er, medmindre andet er angivet. Data blev udtrykt i middelværdier standardafvigelser (std. dev). Betydningen blev bestemt ved hjælp af ikke-parametriske tests (Mann-Hvidney og Kruskal-Vægis H), hvor dataene betragtes som signifikante, når p er mindre end 0,05.

3. Resultater og diskussion

3.1. Sygdomsaktivitet hos forsøgspersoner

tabel 1 viser de demografiske data for de seksten RA-patienter og et sundt individ og deres blodprøveresultater af almindeligt anvendte ra-diagnostiske markører, der angiver deres sygdomsaktiviteter. Baseret på DAS28-CRP-indekset for 16 RA-patienter blev 3 af disse patienter klassificeret som høj sygdomsaktivitet, 8 som moderat aktivitet, 3 som remission og de resterende to som ukendt status på grund af ufuldstændig dataindsamling.

3.2. Generation af LCL ‘er

Pbmc’ er blev høstet fra de seksten RA-patienter og en sund donor (mærket som C) (tabel 1) og kryokonserveret. Alikvoter af kryokonserverede Pbmc ‘ er blev derefter brugt til EBV-infektion. Ud af de sytten kolber blev 15 EBV-transformerede Lcl ‘ er (undtagen 4e og 14a) genereret en uge efter infektion, hvor synlige celleklynger blev set fra kolberne. Når de visualiseres under mikroskop, viste LCL ‘ erne typisk rosetmorfologi med forskellige størrelser som angivet med de røde pile (Figur 1). Succesraten for lcls-generationen var 88,23% (15 ud af 17).

Figur 1

mikroskopisk undersøgelse af PBMC-afledt EBV-udødeliggjort B-celler fra en RA-patient 8A en uge efter infektion. Disse udødelige celler er kommenteret som LCL-8A. røde pile viser de rosetlignende EBV-udødeliggjorte Lcl ‘ er ved 4 gange (øverste panel), 10 gange (midterste panel) og 20 gange (nederste panel) forstørrelser. Skalestænger er angivet i gult.

3.3. Væksthastighed og Fordoblingstidsberegning af genererede Lcl ‘er

vi bestemte derefter vækstraten for hver genereret kategori af LCL’ er ved hjælp af en ikke-lytisk og realtids luminescensbaseret celleproliferationsassay. Figur 2 viser vækstkurven for hver kategori af LCL ‘er repræsenteret af de relative luminescensenheder (RLU’ er). Tabel 2 viser den beregnede fordoblingstid og vækstrate for respektive Lcl ‘ er ved hjælp af en online-regnemaskine . Fra den opnåede fordoblingstid for hver kategori af LCL ‘er deler vi LCL’ erne i to kategorier ved hjælp af 54.69 timer (middelværdi af alle Lcl ‘er) som afskæringsværdi, hvilket resulterede i 10 hurtigt voksende og 5 langsomt voksende Lcl’ er (Tabel 2 og 4) (p<0,05).

figur 2

vækstkurver af LCL ‘ er. Relative luminescensenheder repræsenterer cellernes levedygtighedssignaler på forskellige tidspunkter. De udfyldte linjer repræsenterer de hurtigt voksende Lcl ‘er, mens stiplede linjer repræsenterer de langsomt voksende Lcl’ er.

3.4. Overflademarkørekspression af LCL ‘er

Pbmc’ er og tilsvarende Lcl ‘ er blev underkastet strømningscytometrianalyse for at bestemme deres overflademarkørekspression inklusive CD3, CD19, CD23 og CD27. CD3 og CD19 er overflademarkører for henholdsvis T-celler og B-celler. Ved hjælp af pbmc ‘ erne isoleret fra patient 8A og den tilsvarende LCL-8a som eksempler viser figur 3, Hvordan CD3+ T-cellerne og CD19+ B-cellerne blev profileret og gated ved strømningscytometri. Ekspressionsniveauet blev derefter præsenteret i procent fra det samlede antal analyserede lymfocytter, som var 20.000 celler. I donorernes Pbmc ‘ er var 29,78-81,8% T-celler, mens 2,35-45,95% omfatter B-celler. Efter EBV-transformationen faldt t-cellepopulationer til 0-0, 27%, mens B-cellepopulationer steg til 68,59-89,35%. Dette indikerer tydeligt succesen med B-celle udødeliggørelse af EBV, som har overtaget t-cellepopulationen. CD3 + T-celler senesced og ville blive helt vasket væk fra LCL ‘ erne.

figur 3

T-celle (CD3) og B-celle (CD19) overflademarkørprofilering efter strømningscytometri. Det øverste panel viser analysen af Pbmc ‘er isoleret fra patient 8A, mens det nederste panel viser analysen af de tilsvarende Lcl’ er (LCL-8a). R1: 7AAD – levende celler; R2: lukkede lymfocytter; R3: lukkede CD3+ T-celler; R4: lukkede CD19+ B-celler.

CD23 er en B-celle aktiveringsmarkør, mens CD27 er en markør for hukommelse B-celler . Hos RA-patienter er forhøjede niveauer af CD23-ekspressive B-celler tidligere rapporteret at korrelere positivt med sygdomsaktiviteten, og de kunne potentielt tjene som et terapeutisk mål . I modsætning hertil viste det sig, at CD27+ B-celler korrelerede negativt med sygdomsaktivitet og viste sig at være nedsat hos RA-patienter . I den aktuelle undersøgelse kunne vi ikke differentiere ekspressionsmønsteret for CD23 og CD27 i Pbmc ‘er og LCL’ er (Tabel 3). Figur 4 viser gating af CD19+, CD23+ og CD27+ fra Pbmc ‘ erne isoleret fra patient 8A og den tilsvarende LCL-8a ved strømningscytometri. Fra alle Lcl ‘ er, mens 68,59-89,35% var CD19+ som forventet, udviser de udtryk for CD23 (16,94-58,9%) og CD27 (15,74-80,89%). B-celler, der coudtrykker CD23 og CD27, var 5,72-41,53% (tabel 3).

3.5. Korrelation af sygdomsaktivitet, Overflademarkørekspressionsniveau og LCL-Proliferation

der blev udført en statistisk analyse for at teste sammenhængen mellem sygdomsaktiviteten og overflademarkørudtryk; ingen af dem viste imidlertid betydning. Tilsvarende korrelerede sygdomsaktiviteten ikke med vækstraten for tilsvarende Lcl ‘ er.

fra fordoblingstiden for hver kategori af LCL ‘er blev middelværdier for både hurtigt og langsomt voksende Lcl’ er bestemt og underkastet statistisk analyse. Tabel 4 viser en signifikant forskel (p<0.05) i form af fordobling tid mellem de to kategorier. Tilsvarende blev middelværdierne for cd23 -, CD27-og CD23+CD27+ – niveauerne for den respektive kategori bestemt. De hurtigt voksende Lcl ‘er har højere ekspression af CD23 (42,39%) sammenlignet med de langsomt voksende Lcl’ er (35,28%). Dette er dog ikke statistisk signifikant (Tabel 4). Omvendt var cd27-ekspression og CD23/CD27-coekspression lavere i de hurtigt voksende Lcl ‘er (henholdsvis 36,15 og 13,36%) sammenlignet med de langsomt voksende Lcl’ er (henholdsvis 51,57% og 19,49%). Når en statistisk analyse udføres, viser kun de hurtigt voksende Lcl ‘ er signifikant lavere i CD27, men ikke CD23/CD27-ekspression. Yderligere undersøgelser med større prøvestørrelse er nødvendige for at validere disse fund.

den høje ekspression af CD23 kan skyldes EBV-infektion eller transformation. Der er beviser for, at B-celle udødeliggørelse kan stole på det cellulære CD23-udtryk. Undersøgelsen viste, at CD23-negative B-celler kunne inficeres af EBV, men ikke kunne udødeliggøres, medmindre de supplerede med specifikke vækstfaktorer . En anden undersøgelse viste, at EBV-inficerede B-celler kunne udvikle sig til to forskellige underpopulationer: CD58+IL6 – og CD58+IL6+ . Den tidligere B-celle-underpopulation spredte sig aktivt, mens den sidstnævnte underpopulation ophørte med at sprede sig. Ekspressionen af CD23 kan også induceres ved EBV-nukleart antigen 2 (EBNA-2) ekspression efter EBV-transformation af B-celler som tidligere beskrevet i en Burkitt lymfom (BL) cellelinie . I modsætning hertil kan det højere udtryk for CD27 i langsomt voksende Lcl’ er antyde deres hæmmende virkninger på LCL ‘ ernes spredning.

4. Konklusioner

CD23 kunne spille en stimulerende rolle i EBV-transformation af B-celler og LCLs’ vækst. Vores undersøgelser viste, at de hurtigt voksende Lcl ‘ er udviste højere CD23-udtryk og lavere CD27-udtryk og CD23CD27-udtryk. Yderligere undersøgelser med en større prøvestørrelse er berettiget til at undersøge dybtgående implikationen af overflademarkørekspression på EBV-vedligeholdelse og cellulær vækst.

datatilgængelighed

de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.

interessekonflikter

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter vedrørende offentliggørelsen af denne artikel.

anerkendelser

vi vil gerne takke Dr. Alan Soo-Beng Khoo fra Molecular Pathology Unit, Institute for Medical Research (IMR), Malaysia, for hans generøsitet i at forsyne os med den B95-8 marmoset-afledte EBV for vores udødeliggørelsesarbejde. Hooi-Yeen Yap er modtager af University Master ‘ s Degree ved forskningsstipendium. Denne forskning blev finansieret af Det Internationale forskningsstipendium 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Kræftforskningspris (CRA) 2016 (ekst-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) og forskningsfonde for medicinsk center (SRC/002/2017/FR og SRC/003/2017/FR).

supplerende materialer

tabellen viser de undersøgte tilfælde med diagnosedato, blodprøveudtagning, pbmc ‘er kryopræservering, EBV-udødeliggørelse og varighed af kryopræserverede Pbmc’ er. (Supplerende Materialer)