lihavuus ja siihen liittyvät liitännäissairaudet, esimerkiksi diabetes, kohonnut verenpaine ja sydän-ja verisuonitaudit, ovat maailmanlaajuisesti yleisimpiä terveysriskejä, ja esiintyvyys on yli kaksinkertaistunut viimeisten 35 vuoden aikana ja ilmaantunut jo lapsuudessa. Biologisesti, jotta rasvamassaa kertyisi proliferaation lisäksi, fibroblastin kaltaisten esiastesolujen (preadiposyyttien) erilaistuminen lipiditäytteisiksi kypsiksi adiposyyteiksi on merkittävä kudoslaajentumisprosessi. Siksi molekyylitapahtumien ymmärtäminen tässä adiposyyttien kehitysprosessissa, erilaistumisessa ja biologiassa on yhä tärkeämpää.
Preadiposyyttisolulinjat, kuten hiiren 3T3‐L1 tai hiiren, rotan tai ihmisen primaariset adiposyytit toimivat ihmisen adipogeneesin kokeellisina malleina ja niitä käytetään laajalti kuvaamaan adipogeenisia säätelijöitä ja siten antamaan merkittäviä tietoja adipogeneesiä säätelevistä molekyyliprosesseista. Ihmisen adipogeneesin fysiologiaan liittyy kuitenkin joitakin rajoituksia, sillä esimerkiksi 3T3-L1-solut ovat spontaanisti ikuistettuja aneuploidisia alkion fibroblasteja ja ne ovat peräisin hiirestä. Toisaalta ihmisen primaariset preadiposyytit eivät voi laajentua suuriksi solumääriksi menettämättä kykyään erilaistua kypsiksi adiposyyteiksi. Lisäksi yksilöiden soluviljelmissä esiintyy suurta yksilöiden välistä vaihtelua, mikä rajoittaa yleistettävyyttä.
vuonna 2001 perustettiin Simpson–Golabi–Behmelin oireyhtymää (SGBS) sairastavasta pojasta johdettu ihmisen preadiposyyttisolulinja, joka osoittautui sopivaksi mallijärjestelmäksi adiposyyttitutkimuksessa tehtäviin in vitro-tutkimuksiin. Sgbs-preadiposyytit ovat ihmisperäisiä, diploidisia, erilaistuvat seerumivapaassa, kemiallisesti standardoidussa väliaineessa ja mahdollistavat toistettavissa olevat kokeet, koska solujen määrää voidaan suurelta osin lisätä samalla, kun solut säilyttävät hyvän erilaistumiskykynsä yli 30 sukupolven ajan. SGBS-mallia on käytetty lukuisissa tutkimuksissa, kuten farmakologisissa testeissä, adiposyyttibiologian geneettisissä vaikutuksissa ja adipogeneesissä tai adipokiinien luonnehdinnassa. Periaatteen todistuksena geenien, kuten GLUT4: n, leptiinin tai lipoproteiinilipaasin (LPL), ekspressioprofiilien SGBS: n preadiposyyttien erottamisessa on osoitettu muistuttavan ihmisen primaaristen preadiposyyttien rasvakudosbiopsioita. SGBS: n preadiposyyteistä erittämien proteiinien ja erilaistuneiden sgbs-adiposyyttien laadullista vertailua ei kuitenkaan ole vielä tehty.
tässä teimme kattavan analyysin SGBS-solujen proteiini-ja ekspressioprofiilista adiposyyttien erilaistumisen aikana. Ihmisen sgbs-preadiposyyttien solut erilaistuivat aiemmin kuvatulla tavalla, jotta voitaisiin luonnehtia rasvasolujen erilaistumista proteomi-ja transkriptomi-tasolla. Dmem/Ham: n F12: ssa erotettiin lyhyesti subnfluenttiset sgbs-preadiposyytit, jotka sisälsivät 33 µm biotiinia, 17 µm pantotenaattia, 10 µg mL apo‐transferriinia, 20 nm insuliinia, 10 nm hydrokortisonia ja 0, 2 nm trijodityroksiinia 10 päivän ajan. Ensimmäisten 4 erilaistumispäivän aikana väliainetta täydennettiin lisäksi 25 nm: n deksametasonilla, 500 µm: n isobutyylimetyyliksantiinilla ja 2 µm: n rosiglitatsonilla (tarkemmat tiedot, ks.tukitiedot).
proteomianalyysissä käytimme stabiileja Isotooppimerkintöjä soluviljelmässä (SILAC) yhdistettynä LC‐MS/MS: ään solunsisäisten ja eritettyjen proteiinien tarkassa kvantitatiivisessa proteomianalyysissä edellä kuvatulla tavalla. Kaikki kokeet tehtiin biologisina kolmina kappaleina.
tunnistimme 3737 solunsisäistä proteiinia, joista 2602 määritettiin luotettavasti ainakin kahdessa kolmesta biologisesta rinnakkaisnäytteestä. Sekretomianalyysissä tunnistettiin 390 proteiinia, joista määritettiin 39 proteiinia, jotka sisälsivät vakiintuneita adipogeenisia säätelijöitä ja modulaattoreita, kuten apolipoproteiini E (APOE) ja adiponektiini (ADIPOQ). Kaiken kaikkiaan lähes puolet solunsisäisistä ja solunulkoisista proteiineista ilmeni eri tavoin adiposyyttien erilaistumisen aikana (Kuva 1a).
proteiinien subsellulaarisen lokalisoinnin analyysi GO: n (gene ontology) tietokantahuomautuksen mukaisesti osoitti sytoplasmaproteiinien, mutta myös ydin-ja mitokondrioproteiinien rikastumista (Kuva 1b). 1135 solunsisäisen proteiinin ja 18 erittämän proteiinin määritettiin säätelevän merkittävästi siten, että log2-kertainen muutos oli >0.5 ja p-arvo <0, 01 (kaksihäntäinen t‐testi epätasaisella varianssilla) (Kuva 1C, taulukko S1, tukevat tiedot).
kaikki säännellyt proteiinit ryhmiteltiin merkittyjen GO: n biologisten prosessien ja kanonisten reittien mukaisesti sekä Kioto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) – tietosanakirjan mukaisesti. Suurin osa säännellyistä proteiineista osallistuu aineenvaihduntareitteihin, esimerkiksi trikarboksyylikiertoon ja mitokondrioiden hengitystieketjuun, sekä rasvahappojen beetaoksidaatioon (Kuva 2a). Molekyyliproteiinifunktioiden analyysi osoitti Poly(a) RNA: ta sitovien proteiinien, kadheriinipohjaisten solu‐solu‐vuorovaikutusproteiinien, oksidoreduktaasien, ribosomaalisten proteiinien ja aktiinia sitovien proteiinien rikastumista (Kuva 2b). Eri tavoin ilmentyvien proteiinien Kegg-reittianalyysi paljasti, että aminohappojen aineenvaihdunta, soluhengitys ja rasvahappojen aineenvaihdunta olivat merkittävimpiä säädeltyjä (Kuva 2C). Useita proteiineja mukana peroksisome proliferator-activated receptory (PPARy) signalointireitti oli regulated, kuten edellä on kuvattu. Yhdessä erilaistuminen adiposyyttien liittyy suuri ero proteiinin ilmentymisen lipidi-ja aminohappo aineenvaihduntaa liittyvät reitit ovat eniten vaikuttaa niistä.
proteomin kattavaa analyysiä varten suhteessa transkriptomiin analysoimme edelleen geenin ekspressioprofiilia adipogeneesin aikana Affymetrix GeneChip-Ekspressioanalyysillä. Tätä varten käsiteltiin 5 µg kokonais-RNA: ta mikroarray-analyysiä varten. Näytteiden käänteistranskriptio, in vitro-transkriptio, fragmentaatio ja hybridisaatio suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti. Näytteet hybridisoitiin HG U133A 2.0-matriiseihin. Skannaus ja ensimmäinen tietojenkäsittely toteutettiin GeneChip-käyttöjärjestelmällä. Sample cell intensity (cel) – tiedostot tuotiin genespring GX 7.3: een. (Agilent, Palo Alto, USA) käyttämällä RMA-algoritmia raakatietojen käsittelyyn. Jokaisen ryhmän jokainen geeni normalisoitiin kyseisen geenin kaikkien mittausten mediaaniin. Geenin ei yleensä katsottu ilmentyvän, kun raa ’ an lausekkeen signaali oli kaikissa näytteissä alle 100. On vakuuttavaa, että pääkomponenttianalyysissä näytteet on ryhmitelty eriytymisen eri vaiheisiin (Kuva S1, tukitiedot). Tilastollista analyysia varten näytteet ryhmiteltiin preadiposyytteihin (n = 3), varhaiseen erilaistumiseen (N = 3), välifenotyyppiin (n = 2) ja kypsiin adiposyytteihin (n = 3) ilmaisuprofiilien (tukitietojen) mukaan. Geenien välisen Virhemallin estimoimia variansseja käytettiin edelleen tilastollisissa testeissä. Tiedot talletettiin Proteomics identifications database (pride) – tietokantaan (ID PXD012476) ja GEO-tietokokonaisuuksiin GSE123385.
yhteensä 14372 testattua transkriptiä 22277: stä ilmaistiin SGBS-soluissa missä tahansa erilaistumisvaiheessa koodaten 9346 yksittäistä proteiinia. Niistä 1520 määritettiin myös proteiinitasolla (taulukko S2, tukitiedot). 313 geenissä (3, 3%), joita edusti 404 (2, 8%) transkriptiä, esiintyi ekspressiomuutoksia >viisinkertaisesti adiposyyttien erilaistumisen aikana (taulukko S3, tukitiedot). Korrelaatioanalyysit osoittivat, että säätely proteiinitasolla vastasi hyvin transkriptomitasoa, jossa adiposyyttejä verrattiin preadiposyytteihin (Kuva S2, Tukitieto).
seuraavaksi analysoimme tyypillistä adipogeneesin aikaista adipogeneesiä transkriptomi-ja proteomitasolla testataksemme erilaistumisen molekyylijäljen kestävyyttä. Löysimme adiponektiiniekspressioon osallistuvien proteiinien, kolesterolin synteesin (asetyyli‐CoA‐asetyylitransferaasi, lipaasi E), aminohappojen metabolian (aminoasylaasi) ja lipogeneesiin ja lipolyysiin liittyvien tekijöiden (asetyyli-CoA-karboksylaasi α Ja β (ACACA, ACACB)) säätelyn. Lisäksi kypsille adiposyyteille tyypilliset markkerit, kuten LPL, rasvahappoa sitova proteiini 4 (FABP4), rasvahapposyntaasi (FASN), stearoyyli‐CoA-desaturaasi ja APOE, säädeltiin uudelleen. Sen sijaan lateksiinin (LXN), karboksipeptidaasi A1: n, 2: n ja 4: n inhibiittorin, havaittiin olevan downregulated. Tunnistimme kolme preadiposyytti markkereita, LXN, transkriptio tekijä GATA-6 (GATA6), ja C‐X‐C motiivi kemokiini 6 (CXCL6), ja neljä kypsä adiposyytti markkereita LPL, ACACB, APOE, ja ATP sitraattilyaasi (ACLY) (Kuva S3, tukevat tiedot).
vahvistaaksemme merkkigeenin ekspressioprofiilit ja tunnistaaksemme ne, joilla on korkein rasvasolujen tilan ennustamiskyky, suoritimme taqman RT‐PCR: n kolmessa riippumattomassa SGBS: n erilaistumiskokeessa (tukevat tiedot). SGBS-soluissa pystyimme validoimaan kaikkien seitsemän merkkigeenin geeniekspressioprofiilit ja osoitimme merkittävää säätelyä SGBS: n erilaistumisen aikana. Myös viisi qPCR: llä validoitua merkkigeeniä SGBS-soluissa säädeltiin samaan suuntaan proteomitasolla (kuva 3). Acacb: n, ASYYLIN, ADIPOQIN ja APOE: n säätelyarvot olivat kypsissä adiposyyteissä merkittävästi korkeammalla, kun taas LXN: n säätelyarvot olivat merkittävästi alemmalla tasolla.
yhdessä SGBS-adiposyyteissä on nisäkkäiden primaaristen adiposyyttien keskeisiä piirteitä ja keskeisiä proteiini-ja mRNA-merkkejä, esimerkiksi morfologisia ominaisuuksia sekä molekyylituntomerkkejä, kuten PPARy-reitin aktivoituminen. Tässä osoitamme, että myös useiden tyypillisten adipokiinien (esim.ADIPOQ) ja kypsien adiposyyttien (esim. LPL, FABP4, FASN) ilmentyminen indusoidaan SGBS-solujen erilaistumisessa. Lisäksi saadut tiedot osoittavat metabolisen ohjelmoinnin aikana adipogeneesin, rasva-aineenvaihduntaan liittyvät reitit ovat eniten vaikuttaa.
odotamme tässä esitettyjen proteomiikka‐ja transkriptomiikkatietojen olevan kiinnostavia SGBS-solujen soveltamisessa ja vakiinnuttamisessa hyvin ominaisena mallijärjestelmänä adiposyyttien erilaistumista varten sekä merkkigeenien tunnistamisessa, joita voidaan käyttää ihmisen rasvakudoksen koepalojen luonnehtimiseen koostumuksen ja erilaistumistilan suhteen. Tietomme voivat helpottaa ja ohjata tulevia tutkimuksia, joissa keskitytään adipogeneesin ja ihmisen adiposyyttien säätelyyn.