obezitatea și comorbiditățile asociate, de exemplu, diabetul, hipertensiunea și bolile cardiovasculare, reprezintă cele mai frecvente riscuri pentru sănătate la nivel mondial, iar prevalența s-a dublat în ultimii 35 de ani și a apărut deja în copilărie. Din punct de vedere biologic, pentru ca masa de grăsime să se acumuleze pe lângă proliferare, diferențierea celulelor precursoare asemănătoare fibroblastelor (preadipocite) în adipocite mature umplute cu lipide este un proces major de expansiune tisulară. Prin urmare, înțelegerea evenimentelor moleculare în acest proces de dezvoltare, diferențiere și biologie a adipocitelor are o importanță tot mai mare.
liniile celulare Preadipocitare, cum ar fi murin 3T3‐L1, sau adipocitele primare de la șoareci, șobolani sau oameni servesc ca modele experimentale pentru adipogeneza umană și sunt utilizate pe scară largă pentru a caracteriza regulatorii adipogeni și, prin urmare, oferă informații substanțiale despre procesele moleculare care reglează adipogeneza. Cu toate acestea, există unele constrângeri privind generalizarea fiziologiei adipogenezei umane, cum ar fi, de exemplu, celulele 3T3‐L1 sunt fibroblaste embrionare aneuploide imortalizate spontan și sunt derivate din șoarece. Pe de altă parte, preadipocitele umane primare nu pot fi extinse la un număr mare de celule fără a-și pierde capacitatea de a se diferenția în adipocite mature. Mai mult, există un grad ridicat de variabilitate interindividuală pentru culturile tranzitorii din celulele indivizilor, limitând astfel generalizabilitatea.
în 2001, a fost stabilită o linie celulară preadipocitară umană derivată de la un băiat cu sindromul Simpson–Golabi–Behmel (SGBS), care s-a dovedit a fi un sistem model adecvat pentru studiile in vitro în cercetarea adipocitelor. Preadipocitele SGBS sunt de origine umană, diploide, se diferențiază într-un mediu fără ser, standardizat chimic și permit experimente reproductibile, deoarece numărul de celule poate fi în mare măsură crescut, în timp ce celulele își păstrează capacitatea de diferențiere bună pentru mai mult de 30 de generații. Modelul SGBS a fost utilizat pentru numeroase studii, cum ar fi testarea farmacologică, influențele genetice asupra biologiei adipocitelor și adipogeneza sau caracterizarea adipokinelor. Ca dovadă a principiului, profilurile de Expresie ale genelor precum GLUT4, leptina sau lipoprotein lipaza (LPL) în diferențierea preadipocitelor SGBS s-au dovedit a fi asemănătoare cu cele pentru preadipocitele umane primare din biopsiile țesutului adipos. O comparație calitativă a proteinelor secretate din preadipocitele SGBS și adipocitele sgbs diferențiate nu a fost încă efectuată.
aici am efectuat o analiză cuprinzătoare a profilului proteic și de Expresie al celulelor SGBS în timpul diferențierii adipocitelor. Pentru a caracteriza diferențierea adipocitelor la nivel de proteom și transcriptom, celulele preadipocite sgbs umane au fost diferențiate așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, preadipocitele sgbs subcofluente au fost diferențiate în DMEM/Ham ‘ s F12 conținând biotină 33, pantotenat 17, apo-transferină 10, insulină 20 nm, hidrocortizon 10 nm și triiodotiroxină 0,2 nm timp de 10 zile. În primele 4 zile de diferențiere, mediul a fost suplimentat suplimentar cu dexametazonă de 25 nm, izobutil‐metilxantină de 500 XQQ și rosiglitazonă de 2 XQQ (pentru informații detaliate, a se vedea informațiile justificative).
pentru analiza proteomilor, am folosit etichetarea izotopilor stabili în cultura celulară (SILAC) combinată cu LC‐MS/MS pentru o analiză cantitativă exactă în profunzime a proteinelor intracelulare și secretate așa cum a fost descris anterior. Toate experimentele au fost efectuate în triplicate biologice.
am identificat 3737 proteine intracelulare din care 2602 au fost cuantificate în mod fiabil în cel puțin două dintre cele trei replici biologice. În analiza secretomului, au fost identificate 390 de proteine, dintre care 39 de proteine au inclus regulatori adipogeni stabiliți și modulatori precum apolipoproteina e (APOE) și adiponectina (ADIPOQ) au fost cuantificate. În general, aproape jumătate din proteinele intracelulare și extracelulare au fost exprimate diferențiat în timpul diferențierii adipocitelor (figura 1a).
analiza localizării subcelulare a proteinelor conform adnotării bazei de date Go (gene ontology) a arătat îmbogățirea proteinelor citoplasmatice, dar și a proteinelor nucleare și mitocondriale (figura 1b). S-a stabilit că 1135 de proteine intracelulare și 18 proteine secretate sunt reglate semnificativ cu o modificare de log2 ori >0.5 și o valoare p < 0,01 (test t cu două cozi cu varianță inegală) (figura 1C, tabelul S1, informații justificative).
toate proteinele reglementate au fost grupate în funcție de procesele biologice adnotate GO și căile canonice, precum și de atribuirea lor căilor metabolice, așa cum este furnizat de Enciclopedia Kyoto a genelor și genomilor (Kegg). Majoritatea proteinelor reglementate sunt implicate în căile metabolice, de exemplu, ciclul tricarboxilic și lanțul respirator mitocondrial, precum și beta‐oxidarea acizilor grași (figura 2a). Analiza funcțiilor proteinelor moleculare a arătat o îmbogățire a proteinelor de legare a ARN‐ului Poli(A), a proteinelor de interacțiune celulă‐celulă pe bază de cadherină, a oxidoreductazelor, a proteinelor ribozomale și a proteinelor de legare a actinei (figura 2b). Analiza căii KEGG a proteinelor exprimate diferențiat a arătat că metabolismul aminoacizilor, respirația celulară și metabolismul acizilor grași au fost printre cele mai semnificativ reglementate (figura 2c). Mai multe proteine implicate în calea de semnalizare a receptorului activat de proliferator peroxizom (PPARy) au fost reglate în sus, așa cum s‐a descris anterior. Luate împreună, diferențierea adipocitelor este însoțită de un grad mare de exprimare diferențială a proteinelor, căile legate de metabolismul lipidelor și aminoacizilor fiind cele mai afectate.
pentru o analiză cuprinzătoare a proteomului în raport cu transcriptomul, am analizat în continuare profilul expresiei genice în timpul adipogenezei printr-o analiză a expresiei Affymetrix GeneChip. Pentru aceasta, pentru analiza microarray s-au procesat 5 hectare de ARN total. Transcrierea inversă, transcrierea in vitro, fragmentarea și hibridizarea probelor au fost efectuate conform recomandărilor producătorului. Probele au fost hibridizate la matrice HG U133A 2.0. Scanarea și prima prelucrare a datelor au fost executate cu software-ul de operare GeneChip. Fișierele sample cell intensity (cel) au fost importate în GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, SUA) folosind algoritmul RMA pentru prelucrarea datelor brute. Fiecare genă din fiecare matrice a fost normalizată la mediana tuturor măsurătorilor acelei gene. O genă a fost în general considerată ca nefiind exprimată atunci când semnalul de Expresie brută a fost sub 100 în toate probele. În mod liniștitor, în analiza componentelor principale, eșantioanele sunt grupate în etape distincte de diferențiere (figura S1, informații justificative). Pentru analiza statistică probele au fost grupate în preadipocite (n = 3), diferențiere timpurie (n = 3), fenotip intermediar (n = 2) și adipocite mature (n = 3) conform profilurilor de Expresie (informații justificative). Varianțele estimate de modelul de eroare a genei încrucișate au fost utilizate în continuare pentru testarea statistică. Datele au fost depozitate în Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) și seturi de date GEO GSE123385.
în total, 14372 din 22277 transcrieri testate au fost exprimate în celule SGBS în orice moment de diferențiere, codificând 9346 de proteine unice. 1520 dintre acestea au fost cuantificate și la nivel proteic (tabelul S2, informații justificative). 313 gene (3,3%) reprezentate de 404 (2,8%) transcrieri au avut modificări de Expresie >de cinci ori în timpul diferențierii adipocitelor (tabelul S3, informații justificative). Analizele de corelație au arătat că reglarea la nivelul proteinei corespunde în mare măsură nivelului transcriptomului comparând adipocitele cu preadipocitele (figura s2, informații justificative).
în continuare, am analizat expresia tipică a markerului adipocitar în timpul adipogenezei la nivel de transcriptom și proteom pentru testarea robusteții semnăturii moleculare de diferențiere. Am constatat o upreglementare a proteinelor implicate în expresia adiponectinei, sinteza colesterolului (acetil‐CoA acetiltransferaza, lipaza e), metabolismul aminoacizilor (aminoacilaza) și a factorilor implicați în lipogeneză și lipoliză (acetil‐CoA carboxilaza și acaca, ACACB)). În plus, markerii tipici ai adipocitelor mature precum LPL, proteina 4 de legare a acizilor grași (FABP4), sintaza acizilor grași (FASN), desaturaza stearoil‐CoA și APOE au fost reglate în sus. În schimb, s-a observat că latexina (LXN), un inhibitor al carboxipeptidazei A1, 2 și 4, este reglată în jos. Am identificat cei trei markeri preadipocitari, LXN, factorul de transcripție GATA‐6 (GATA6) și motivul C‐X‐C chemokina 6 (CXCL6) și cei patru markeri adipocitari maturi LPL, ACACB, APOE și citrat liaza ATP (ACLY) (figura S3, informații justificative).
pentru a valida profilurile de expresie a genei marker și pentru a le identifica pe cele cu cea mai mare capacitate de predicție a stării adipocitelor, am efectuat Taqman RT‐PCR în trei experimente independente de diferențiere SGBS (informații de susținere). În celulele SGBS, am reușit să validăm profilurile de expresie genetică ale tuturor celor șapte gene marker și am arătat o reglare semnificativă în timpul diferențierii SGBS. Cinci gene marker validate cu qPCR în celulele SGBS au fost, de asemenea, reglate în aceeași direcție la nivelul proteomilor (Figura 3). ACACB, acyl, ADIPOQ și APOE au fost reglate în mod semnificativ în adipocitele mature, în timp ce LXN a fost reglat în mod semnificativ.
luate împreună, adipocitele SGBS prezintă caracteristici cheie și semnături cheie de proteine și ARNm ale adipocitelor primare de mamifere, de exemplu, caracteristici morfologice, precum și semne moleculare, cum ar fi activarea căii PPARy. Aici, arătăm că, de asemenea, expresia mai multor adipokine tipice (de exemplu, ADIPOQ) și markeri adipocite maturi (de exemplu, LPL, FABP4, FASN) sunt induse în diferențierea celulelor SGBS. Mai mult, datele obținute relevă o programare metabolică în timpul adipogenezei, căile legate de metabolismul lipidic fiind cele mai afectate.
ne așteptăm ca datele proteomice și transcriptomice prezentate aici să fie de interes pentru aplicarea și stabilirea ulterioară a celulelor SGBS ca un sistem model bine caracterizat pentru diferențierea adipocitelor, precum și pentru identificarea genelor marker, care pot fi utilizate pentru a caracteriza biopsiile țesutului adipos uman în ceea ce privește compoziția și starea de diferențiere. Datele noastre pot facilita și ghida studii viitoare axate pe reglarea adipogenezei și a semnăturilor adipocitelor umane.