Obesità e comorbidità associate, per esempio, il diabete, l’ipertensione e le malattie cardiovascolari, che rappresentano la più comune rischi per la salute in tutto il mondo, e la prevalenza è più che raddoppiato negli ultimi 35 anni e già emerse nell’infanzia. Biologicamente, affinché la massa grassa si accumuli oltre alla proliferazione, la differenziazione delle cellule precursori fibroblasti (preadipociti) in adipociti maturi pieni di lipidi è un importante processo di espansione tissutale. Quindi, la comprensione degli eventi molecolari in questo processo di sviluppo, differenziazione e biologia degli adipociti è di crescente importanza.
Le linee cellulari preadipocitarie, come 3T3‐L1 murino, o adipociti primari di topi, ratti o esseri umani servono come modelli sperimentali per l’adipogenesi umana e sono ampiamente utilizzate per caratterizzare i regolatori adipogeni e quindi fornire informazioni sostanziali sui processi molecolari che regolano l’adipogenesi. Tuttavia, ci sono alcuni vincoli sulla generalizzabilità alla fisiologia dell’adipogenesi umana, come ad esempio, le cellule 3T3-L1 sono spontaneamente immortalate fibroblasti embrionali aneuploidi e derivano dal topo. D’altra parte, i preadipociti umani primari non possono essere espansi a numeri di cellule elevati senza perdere la loro capacità di differenziarsi in adipociti maturi. Inoltre, vi è un alto grado di variabilità interindividuale per colture transitorie da cellule di individui, limitando quindi la generalizzabilità.
Nel 2001 è stata stabilita una linea cellulare preadipocitaria umana derivata da un ragazzo con la sindrome di Simpson–Golabi–Behmel (SGBS), che ha dimostrato di essere un sistema modello adatto per studi in vitro nella ricerca sugli adipociti. I preadipociti SGBS sono di origine umana, diploidi, si differenziano in un siero libero, mezzo chimicamente standardizzato e consentono esperimenti riproducibili poiché i numeri di cellule possono essere ampiamente aumentati mentre le cellule mantengono la loro buona capacità di differenziazione per più di 30 generazioni. Il modello SGBS è stato utilizzato per numerosi studi, come test farmacologici, influenze genetiche sulla biologia degli adipociti e l’adipogenesi o la caratterizzazione delle adipochine. Come prova di principio, i profili di espressione di geni come GLUT4, leptina o lipoproteina lipasi (LPL) nella differenziazione dei preadipociti SGBS hanno dimostrato di assomigliare a quelli dei preadipociti umani primari dalle biopsie del tessuto adiposo. Un confronto qualitativo delle proteine secrete dai preadipociti SGBS e dagli adipociti SGBS differenziati, tuttavia, non è stato ancora eseguito.
Qui abbiamo eseguito un’analisi completa sul profilo proteico e di espressione delle cellule SGBS durante il corso temporale della differenziazione degli adipociti. Al fine di caratterizzare la differenziazione degli adipociti a livello di proteoma e trascrittoma, le cellule preadipociti SGBS umane sono state differenziate come descritto in precedenza. In breve, i preadipociti SGBS subconfluenti sono stati differenziati in F12 di DMEM / Ham contenente biotina da 33 µm, pantotenato da 17 µm, apo‐transferrina da 10 µg mL, insulina da 20 nm, idrocortisone da 10 nm e triiodotiroxina da 0,2 nm per 10 giorni. Per i primi 4 giorni di differenziazione il mezzo è stato ulteriormente integrato con desametasone 25 nm, isobutil‐metilxantina 500 µm e rosiglitazone 2 µm (per informazioni dettagliate vedere Informazioni di supporto).
Per l’analisi del proteoma, abbiamo utilizzato l’etichettatura isotopica stabile in coltura cellulare (SILAC) combinata con LC‐MS/MS per un’accurata analisi quantitativa approfondita del proteoma delle proteine intracellulari e secrete come descritto in precedenza. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicati biologici.
Abbiamo identificato 3737 proteine intracellulari di cui 2602 sono state quantificate in modo affidabile in almeno due delle tre repliche biologiche. Nell’analisi del secretome, sono state identificate 390 proteine di cui 39 proteine incluse regolatori e modulatori adipogenici stabiliti come apolipoproteina E (APOE) e adiponectina (ADIPOQ) sono stati quantificati. Nel complesso, quasi la metà delle proteine intracellulari ed extracellulari sono state espresse in modo differenziale durante la differenziazione degli adipociti (Figura 1A).
L’analisi della localizzazione subcellulare delle proteine secondo l’annotazione del database GO (gene ontology) ha mostrato l’arricchimento delle proteine citoplasmatiche, ma anche delle proteine nucleari e mitocondriali (Figura 1B). 1135 proteine intracellulari e 18 proteine secrete sono state determinate per essere regolate significativamente con un cambiamento di log2 volte > 0.5 e un valore p di < 0,01 (test t a due code con varianza disuguale) (Figura 1C, Tabella S1, informazioni di supporto).
Tutte le proteine regolate sono state raggruppate in base ai processi biologici GO annotati e alle vie canoniche, nonché alla loro assegnazione alle vie metaboliche come fornito dalla Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). La maggior parte delle proteine regolate sono coinvolte in vie metaboliche, ad esempio, ciclo tricarbossilico e catena respiratoria mitocondriale, nonché beta‐ossidazione degli acidi grassi (Figura 2A). L’analisi delle funzioni proteiche molecolari ha mostrato un arricchimento di proteine leganti poli (A) RNA, proteine di interazione cellula‐cellula a base di caderina, ossidoreduttasi, proteine ribosomiali e proteine leganti l’actina (Figura 2B). L’analisi della via di KEGG delle proteine differenzialmente espresse ha rivelato che il metabolismo degli aminoacidi, la respirazione cellulare e il metabolismo degli acidi grassi erano tra i più significativamente regolati (Figura 2C). Diverse proteine coinvolte nella via di segnalazione della ricettività attivata dal proliferatore del perossisoma (PPARy) sono state sovraregolate, come descritto in precedenza. Presi insieme, la differenziazione degli adipociti è accompagnata da un ampio grado di espressione proteica differenziale con le vie correlate al metabolismo dei lipidi e degli aminoacidi che sono le più colpite.
Per un’analisi completa del proteoma in relazione al trascrittoma, abbiamo ulteriormente analizzato il profilo di espressione genica durante l’adipogenesi mediante un’analisi di espressione genechip Affymetrix. Per questo, 5 µg di RNA totale sono stati elaborati per l’analisi microarray. La trascrizione inversa, la trascrizione in vitro, la frammentazione e l’ibridazione dei campioni sono state eseguite secondo le raccomandazioni del produttore. I campioni sono stati ibridati in array HG U133A 2.0. La scansione e la prima elaborazione dei dati sono state eseguite con il software operativo GeneChip. I file CEL (Sample Cell Intensity) sono stati importati in GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) utilizzando l’algoritmo RMA per l’elaborazione dei dati grezzi. Ogni gene su ogni array è stato normalizzato alla mediana di tutte le misurazioni di quel gene. Un gene è stato generalmente considerato come non espresso quando il segnale di espressione grezza era inferiore a 100 in tutti i campioni. In modo rassicurante, nell’analisi dei componenti principali, i campioni sono raggruppati in fasi distinte di differenziazione (figura S1, Informazioni di supporto). Per l’analisi statistica i campioni sono stati raggruppati in preadipociti (n = 3), differenziazione precoce (n = 3), fenotipo intermedio (n = 2) e adipociti maturi (n = 3) secondo i profili di espressione (informazioni di supporto). Le varianze stimate dal modello di errore cross‐Gene sono state ulteriormente utilizzate per test statistici. I dati sono stati depositati in Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) e GEO set di dati GSE123385.
In totale 14372 su 22277 trascritti testati sono stati espressi in cellule SGBS in qualsiasi momento punto di differenziazione, codificando per 9346 proteine uniche. 1520 di questi sono stati quantificati anche a livello proteico (Tabella S2, Informazioni di supporto). 313 geni (3,3%) rappresentati da 404 (2,8%) trascritti hanno avuto cambiamenti di espressione >cinque volte durante la differenziazione degli adipociti (Tabella S3, Informazioni di supporto). Le analisi di correlazione hanno rivelato che la regolazione a livello proteico corrispondeva molto al livello del trascrittoma confrontando gli adipociti con i preadipociti (Figura S2, Informazioni di supporto).
Successivamente, abbiamo analizzato l’espressione tipica dei marcatori adipocitari durante l’adipogenesi a livello di trascrittoma e proteoma per testare la robustezza della firma molecolare della differenziazione. Abbiamo trovato una sovraregolazione delle proteine coinvolte nell’espressione dell’adiponectina, nella sintesi del colesterolo (acetil‐CoA acetiltransferasi, lipasi E), nel metabolismo degli aminoacidi (aminoacilasi) e dei fattori coinvolti nella lipogenesi e lipolisi (acetil‐CoA carbossilasi α e β (ACACA, ACACB)). Inoltre, i marcatori tipici degli adipociti maturi come LPL, la proteina legante gli acidi grassi 4 (FABP4), la sintasi degli acidi grassi (FASN), la desaturasi stearoil‐CoA e l’APOE sono stati sovraregolati. Al contrario, latexina (LXN), un inibitore della carbossipeptidasi A1, 2 e 4 sono stati osservati per essere downregulated. Abbiamo identificato i tre marcatori preadipociti, LXN, fattore di trascrizione GATA – 6 (GATA6) e CXC motif chemokine 6 (CXCL6) e i quattro marcatori adipociti maturi LPL, ACACB, APOE e l’ATP citrato liasi (ACLY) (Figura S3, Informazioni di supporto).
Al fine di convalidare i profili di espressione genica dei marcatori e identificare quelli con la più alta capacità di predizione dello stato degli adipociti, abbiamo eseguito TaqMan RT‐PCR in tre esperimenti di differenziazione SGBS indipendenti (Informazioni di supporto). Nelle cellule SGBS, siamo stati in grado di convalidare i profili di espressione genica di tutti e sette i geni marker e abbiamo mostrato una regolazione significativa durante la differenziazione SGBS. Cinque geni marker validati con qPCR nelle cellule SGBS sono stati regolati nella stessa direzione a livello del proteoma (Figura 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ, e APOE sono stati significativamente upregulated negli adipociti maturi, mentre LXN è stato significativamente downregulated.
Presi insieme, gli adipociti SGBS presentano caratteristiche chiave e firme chiave di proteine e mRNA di adipociti primari di mammiferi, ad esempio, caratteristiche morfologiche e caratteristiche molecolari come l’attivazione della via PPARy. Qui, mostriamo che anche l’espressione di diverse adipochine tipiche (ad esempio, ADIPOQ) e marcatori adipociti maturi (ad esempio, LPL, FABP4, FASN) sono indotti nella differenziazione cellulare SGBS. Inoltre, i dati ottenuti rivelano una programmazione metabolica durante l’adipogenesi, con le vie correlate al metabolismo lipidico che sono le più colpite.
Ci aspettiamo che la proteomica e trascrittomica dati qui presentati per essere di interesse per l’ulteriore applicazione e la creazione di gli organismi sportivi celle come un modello ben caratterizzato sistema per la differenziazione degli adipociti nonché per l’identificazione di geni marcatori che possono essere utilizzati per caratterizzare il grasso umano biopsie di tessuti in termini di composizione e stato di differenziazione. I nostri dati possono facilitare e guidare studi futuri incentrati sulla regolazione dell’adipogenesi e delle firme adipocitarie umane.