La obesidad y las comorbilidades asociadas, por ejemplo, la diabetes, la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares, representan los riesgos para la salud más comunes en todo el mundo y la prevalencia se ha más que duplicado en los últimos 35 años y ya surgió en la infancia. Biológicamente, para que la masa grasa se acumule además de la proliferación, la diferenciación de células precursoras similares a fibroblastos (preadipocitos) en adipocitos maduros llenos de lípidos es un proceso importante de expansión tisular. Por lo tanto, la comprensión de los eventos moleculares en este proceso de desarrollo, diferenciación y biología de adipocitos es de creciente importancia.
Las líneas celulares de preadipocitos, como el 3T3‐L1 murino, o los adipocitos primarios de ratones, ratas o seres humanos, sirven como modelos experimentales para la adipogénesis humana y se utilizan ampliamente para caracterizar reguladores adipogénicos y, por lo tanto, proporcionan información sustancial sobre los procesos moleculares que regulan la adipogénesis. Sin embargo, hay algunas limitaciones en la generalización a la fisiología de la adipogénesis humana, como por ejemplo, las células 3T3‐L1 son fibroblastos embrionarios aneuploides espontáneamente inmortalizados y se derivan de ratones. Por otro lado, los preadipocitos humanos primarios no pueden expandirse a un número elevado de células sin perder su capacidad de diferenciarse en adipocitos maduros. Además, hay un alto grado de variabilidad interindividual para los cultivos transitorios de células de individuos, lo que limita la generalización.
En 2001, se estableció una línea celular de preadipocitos humanos derivada de un niño con síndrome de Simpson–Golabi–Behmel (SGBS), que demostró ser un sistema modelo adecuado para estudios in vitro en investigación de adipocitos. Los preadipocitos de SGB son de origen humano, diploides, se diferencian en un medio estandarizado químicamente libre de suero y permiten experimentos reproducibles, ya que el número de células se puede aumentar en gran medida, mientras que las células conservan su buena capacidad de diferenciación por más de 30 generaciones. El modelo SGBS se ha utilizado para numerosos estudios, como pruebas farmacológicas, influencias genéticas en la biología de adipocitos y adipogénesis o la caracterización de adipocinas. Como prueba de principio, se ha demostrado que los perfiles de expresión de genes como GLUT4, leptina o lipoproteína lipasa (LPL) en la diferenciación de preadipocitos SGB se parecen a los de los preadipocitos humanos primarios de biopsias de tejido adiposo. Sin embargo, aún no se ha realizado una comparación cualitativa de proteínas secretadas de preadipocitos de SGB y adipocitos diferenciados de SGB.
Aquí realizamos un análisis exhaustivo del perfil proteico y de expresión de las células SGB durante el curso temporal de la diferenciación de adipocitos. Para caracterizar la diferenciación de adipocitos a nivel de proteoma y transcriptoma, las células de preadipocitos de SGB humanos se diferenciaron como se describió anteriormente. Brevemente, los preadipocitos de SGB subconfluentes se diferenciaron en F12 de DMEM / Ham conteniendo biotina de 33 µm, pantotenato de 17 µm, apotransferrina de 10 µg / ml, insulina de 20 nm, hidrocortisona de 10 nm y triyodotiroxina de 0,2 nm durante 10 días. Durante los primeros 4 días de diferenciación, el medio se complementó adicionalmente con dexametasona de 25 nm, isobutil‐metilxantina de 500 µm y rosiglitazona de 2 µm (para información detallada, consulte la Información de apoyo).
Para el análisis de proteomas, utilizamos el Etiquetado de isótopos Estables en Cultivos Celulares (SILAC) combinado con LC-MS / MS para un análisis cuantitativo preciso y en profundidad de proteomas de proteínas intracelulares y secretadas como se describió anteriormente. Todos los experimentos se realizaron en triplicados biológicos.
Identificamos 3737 proteínas intracelulares de las cuales 2602 se cuantificaron de manera confiable en al menos dos de las tres réplicas biológicas. En el análisis de secretomas, se identificaron 390 proteínas, de las cuales se cuantificaron 39 proteínas que incluían reguladores adipogénicos establecidos y moduladores, como la apolipoproteína E (APOE) y la adiponectina (ADIPOQ). En general, casi la mitad de las proteínas intracelulares y extracelulares se expresaron de forma diferencial durante la diferenciación de adipocitos (Figura 1A).
El análisis de la localización subcelular de proteínas según la anotación de la base de datos GO (gene ontology) mostró enriquecimiento de proteínas citoplasmáticas, pero también de proteínas nucleares y mitocondriales (Figura 1B). se determinó que 1135 proteínas intracelulares y 18 proteínas secretadas estaban reguladas significativamente con un cambio log2 de > 0.5 y un valor de p < 0,01 (prueba t de dos colas con varianza desigual) (Figura 1C, Tabla S1, Información de apoyo).
Todas las proteínas reguladas se agruparon de acuerdo con los procesos biológicos de GO anotados y las vías canónicas, así como con su asignación a las vías metabólicas según lo dispuesto por la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG). La mayoría de las proteínas reguladas están involucradas en las vías metabólicas, por ejemplo, el ciclo tricarboxílico y la cadena respiratoria mitocondrial, así como la beta oxidación de ácidos grasos (Figura 2A). El análisis de las funciones moleculares de las proteínas mostró un enriquecimiento de proteínas de unión al ARN poli(A), proteínas de interacción celular a base de cadherina, oxidorreductasas, proteínas ribosómicas y proteínas de unión a actina (Figura 2B). El análisis de la vía KEGG de las proteínas expresadas diferencialmente reveló que el metabolismo de los aminoácidos, la respiración celular y el metabolismo de los ácidos grasos se encontraban entre los más regulados (Figura 2C). Varias proteínas involucradas en la vía de señalización receptora activada por proliferadores de peroxisomas (PPARy) se regularon al alza, como se describió anteriormente. En conjunto, la diferenciación de los adipocitos se acompaña de un gran grado de expresión diferencial de proteínas, siendo las vías relacionadas con el metabolismo de lípidos y aminoácidos las más afectadas.
Para un análisis exhaustivo del proteoma en relación con el transcriptoma, analizamos el perfil de expresión génica durante la adipogénesis mediante un Análisis de Expresión de GeneChip Affymetrix. Para esto, se procesaron 5 µg de ARN total para el análisis de microarrays. La transcripción inversa, la transcripción in vitro, la fragmentación y la hibridación de las muestras se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras se hibridaron a matrices de HG U133A 2.0. El escaneo y el primer procesamiento de datos se ejecutaron con el software operativo GeneChip. Los archivos de intensidad de celda de muestra (CEL) se importaron a GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, EE. UU.) utilizando el algoritmo RMA para el procesamiento de datos sin procesar. Cada gen de cada matriz se normalizó a la mediana de todas las mediciones de ese gen. Un gen se consideraba generalmente como no expresado cuando la señal de expresión cruda estaba por debajo de 100 en todas las muestras. Tranquilizador, en el análisis de componentes principales, las muestras se agrupan en distintas etapas de diferenciación (Figura S1, Información de apoyo). Para el análisis estadístico, las muestras se agruparon en preadipocitos (n = 3), diferenciación temprana (n = 3), fenotipo intermedio (n = 2) y adipocitos maduros (n = 3) de acuerdo con los perfiles de expresión (Información de apoyo). Las varianzas estimadas por el Modelo de Error de Genes Cruzados se utilizaron posteriormente para pruebas estadísticas. Los datos se depositaron en la base de datos de identificación proteómica (PRIDE) (ID PXD012476) y en los conjuntos de datos geográficos GSE123385.
En total, 14372 de 22277 transcripciones probadas se expresaron en células SGB en cualquier momento de diferenciación, codificando 9346 proteínas únicas. 1520 de ellos se cuantificaron también a nivel de proteínas (Tabla S2, Información de apoyo). 313 genes (3,3%) representados por 404 transcripciones (2,8%) tuvieron cambios de expresión >cinco veces durante la diferenciación de adipocitos (Tabla S3, Información de apoyo). Los análisis de correlación revelaron que la regulación a nivel proteico correspondía en gran medida al nivel del transcriptoma comparando los adipocitos con los preadipocitos (Figura S2, Información de apoyo).
A continuación, analizamos la expresión típica de marcadores de adipocitos durante la adipogénesis a nivel de transcriptoma y proteoma para probar la robustez de la firma molecular de diferenciación. Encontramos una regulación ascendente de las proteínas involucradas en la expresión de adiponectina, la síntesis de colesterol (acetil‐COA acetiltransferasa, lipasa E), el metabolismo de aminoácidos (aminoacilasa) y de los factores involucrados en la lipogénesis y la lipólisis (acetil‐coa carboxilasa α y β (ACACA, ACACB)). Además, marcadores típicos de adipocitos maduros como LPL, proteína 4 de unión a ácidos grasos (FABP4), sintasa de ácidos grasos (FASN), desaturasa de estearoil‐CoA y APOE se regularon al alza. En contraste, se observó que la latexina (LXN), un inhibidor de la carboxipeptidasa A1, 2 y 4, estaba regulada a la baja. Identificamos los tres marcadores preadipocitarios, LXN, factor de transcripción GATA‐6 (GATA6) y quimiocina C‐X-C con motivo 6 (CXCL6), y los cuatro marcadores de adipocitos maduros LPL, ACACB, APOE y la citrato liasa ATP (ACLY) (Figura S3, Información de apoyo).
Con el fin de validar los perfiles de expresión de genes marcadores e identificar aquellos con la mayor capacidad de predicción de estado de adipocitos, realizamos TaqMan RT‐PCR en tres experimentos independientes de diferenciación de SGB (Información de apoyo). En células SGB, pudimos validar los perfiles de expresión génica de los siete genes marcadores y mostramos una regulación significativa durante la diferenciación de SGB. Cinco genes marcadores validados con qPCR en células SGBS también se regularon en la misma dirección a nivel de proteoma (Figura 3). ACACB, ACIL, ADIPOQ y APOE se regularon significativamente al alza en adipocitos maduros, mientras que LXN se reguló significativamente a la baja.
Tomados en conjunto, los adipocitos SGB exhiben características clave y firmas clave de proteínas y ARNm de los adipocitos primarios de mamíferos, por ejemplo, características morfológicas, así como características moleculares como la activación de la vía PPARy. Aquí, mostramos que también la expresión de varias adipocinas típicas (por ejemplo, ADIPOQ) y marcadores de adipocitos maduros (por ejemplo, LPL, FABP4, FASN) se inducen en la diferenciación celular de SGBS. Además, los datos obtenidos revelan una programación metabólica durante la adipogénesis, siendo las vías relacionadas con el metabolismo lipídico las más afectadas.
Esperamos que los datos proteómicos y transcriptómicos presentados aquí sean de interés para la aplicación y el establecimiento de células SGB como un sistema modelo bien caracterizado para la diferenciación de adipocitos, así como para la identificación de genes marcadores, que pueden usarse para caracterizar biopsias de tejido adiposo humano en términos de composición y estado de diferenciación. Nuestros datos pueden facilitar y orientar futuros estudios centrados en la regulación de la adipogénesis y las firmas de adipocitos humanos.