az elhízás és a kapcsolódó társbetegségek, például a cukorbetegség, a magas vérnyomás és a szív-és érrendszeri betegségek jelentik a leggyakoribb egészségügyi kockázatokat világszerte, és a prevalencia több mint kétszeresére nőtt az elmúlt 35 évben, és már gyermekkorban felmerült. Biológiailag ahhoz, hogy a zsírtömeg felhalmozódjon a proliferáció mellett, a fibroblasztszerű prekurzor sejtek (preadipociták) lipidtel töltött Érett adipocitákká történő differenciálódása a szövetek terjeszkedésének egyik fő folyamata. Ezért a megértés a molekuláris események ebben a folyamatban a adipocita fejlődés, differenciálódás, és a biológia egyre fontosabb.
a Preadipocita sejtvonalak, mint például az egér 3T3‐L1, vagy az egerek, patkányok vagy emberek primer adipocitái kísérleti modellként szolgálnak az emberi adipogenezishez, és széles körben használják az adipogén szabályozók jellemzésére, és ezáltal lényeges betekintést nyújtanak az adipogenezist szabályozó molekuláris folyamatokba. Mindazonáltal vannak bizonyos korlátok az emberi adipogenezis fiziológiájának általánosítására, például a 3T3-L1 sejtek spontán immortalizálódnak aneuploid embrionális fibroblasztok és egérből származnak. Másrészt az elsődleges humán preadipociták nem bővíthetők magas sejtszámra anélkül, hogy elveszítenék az érett adipocitákká történő differenciálódási képességüket. Továbbá, az egyének sejtjeiből származó tranziens kultúrák esetében nagyfokú az egyének közötti variabilitás, ezáltal korlátozva az általánosíthatóságot.
2001–ben létrehoztak egy Simpson–Golabi-Behmel szindrómában (SGBS) szenvedő fiúból származó humán preadipocita sejtvonalat, amelyről kimutatták, hogy megfelelő Modellrendszer az in vitro vizsgálatokhoz az adipocita kutatásban. Az SGBS preadipociták emberi eredetűek, diploidak, szérummentes, kémiailag standardizált közegben differenciálódnak, és reprodukálható kísérleteket tesznek lehetővé, mivel a sejtek száma nagymértékben növelhető, miközben a sejtek több mint 30 generáción keresztül megőrzik jó differenciálódási képességüket. Az SGBS modellt számos tanulmányhoz használták, mint például a farmakológiai tesztelés, az adipocita biológiára gyakorolt genetikai hatások, az adipogenezis vagy az adipokinek jellemzése. Az elv bizonyítékaként az olyan gének expressziós profiljai, mint a GLUT4, a leptin vagy a lipoprotein lipáz (LPL) az SGBS preadipociták differenciálásában kimutatták, hogy hasonlítanak a primer humán preadipociták zsírszövetből biopsziák. Az SGBS preadipocitákból és a differenciált sgbs adipocitákból kiválasztott fehérjék kvalitatív összehasonlítását azonban még nem végezték el.
itt átfogó elemzést végeztünk az SGBS sejtek fehérje-és expressziós profiljáról az adipocita differenciálódás ideje alatt. Annak érdekében, hogy jellemezzük az adipocita differenciálódást proteom és transzkriptom szinten, a humán sgbs preadipocyták sejtjeit a korábban leírtak szerint differenciáltuk. Röviden, a szubfluens sgbs preadipocitákat DMEM/Ham F12‐ben differenciáltuk, amely 33 db biotint, 17 db pantotenátot, 10 db ml apo-transzferrint, 20 nm inzulint, 10 nm hidrokortizont és 0,2 nm trijódtiroxint tartalmazott 10 napon keresztül. A differenciálás első 4 napján a táptalajt kiegészítettük 25 nm-es dexametazonnal, 500 mm‐es izobutil-metilxantinnal és 2 db 6 mm-es roziglitazonnal (részletes információkért lásd az alátámasztó információkat).
a proteom analízishez stabil Izotópjelölést használtunk sejttenyészetben (SILAC) kombinálva LC-MS / MS‐vel az intracelluláris és szekretált fehérjék pontos, mélyreható kvantitatív proteom analíziséhez, amint azt korábban leírtuk. Minden kísérletet biológiai triplikátumokban végeztünk.
3737 intracelluláris fehérjét azonosítottunk, amelyek közül 2602 megbízhatóan számszerűsíthető volt a három biológiai replikátum közül legalább kettőben. A secretome analízis során 390 fehérjét azonosítottak, amelyek közül 39 fehérjét tartalmaztak olyan ismert adipogén szabályozók és modulátorok, mint az apolipoprotein E (APOE) és az adiponektin (ADIPOQ). Összességében az intracelluláris és az extracelluláris fehérjék csaknem fele különbözően expresszálódott az adipocyta differenciálódás során (1a.ábra).
a fehérjék szubcelluláris lokalizációjának elemzése a GO (gene ontology) adatbázis kommentárja szerint a citoplazmatikus fehérjék, de a nukleáris és mitokondriális fehérjék dúsulását is kimutatta (1b ábra). 1135 intracelluláris fehérje és 18 szekretált fehérje szignifikánsan szabályozott volt a >0 log2-szeres változással.5 és p-értéke < 0,01 (Kétfarkú T‐teszt egyenlőtlen varianciával) (1C ábra, S1 táblázat, alátámasztó információk).
az összes szabályozott fehérjét csoportosítottuk az annotált GO biológiai folyamatok és kanonikus útvonalak, valamint a metabolikus útvonalakhoz való hozzárendelésük szerint, amint azt a Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) biztosítja. A szabályozott fehérjék többsége részt vesz a metabolikus útvonalakban, például a trikarbonsav ciklusban és a mitokondriális légzési láncban, valamint a zsírsav béta‐oxidációjában (2a.ábra). A molekuláris fehérjefunkciók elemzése a poli(A) RNS‐kötő fehérjék, a kadherin‐alapú sejt-sejt interakciós fehérjék, az oxidoreduktázok, a riboszomális fehérjék és az aktinkötő fehérjék dúsulását mutatta (2b.ábra). A differenciálisan expresszált fehérjék Kegg útvonalának elemzése azt mutatta, hogy az aminosav-metabolizmus, a sejtlégzés és a zsírsav-metabolizmus a legjelentősebb szabályozottak közé tartozik (2C ábra). A peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor (PPARy) jelátviteli útvonalban részt vevő számos fehérjét a korábban leírtak szerint szabályoztuk. Összességében az adipociták differenciálódását nagyfokú differenciális fehérje expresszió kíséri, a lipid-és aminosav-anyagcserével kapcsolatos utak a leginkább érintettek.
a proteom átfogó elemzéséhez a transzkriptomhoz viszonyítva, tovább elemeztük a génexpressziós profilt az adipogenezis során Affymetrix GeneChip expressziós elemzéssel. Ehhez a teljes RNS 5G-ját dolgoztuk fel mikroarray elemzésre. A minták reverz transzkripcióját, in vitro transzkripcióját, fragmentációját, hibridizációját a gyártó ajánlásai szerint végeztük. A mintákat Hg U133A 2.0 tömbökkel hibridizáltuk. A szkennelést és az első adatfeldolgozást GeneChip operációs szoftverrel hajtották végre. A minta sejtintenzitás (cel) fájlokat a GeneSpring GX 7.3-ba importáltuk. (Agilent, Palo Alto, USA) az RMA algoritmus használata a nyers adatfeldolgozáshoz. Minden tömb minden génjét normalizáltuk az adott gén összes mérésének mediánjára. Egy gént általában nem expresszáltnak tekintettek, ha a nyers expressziós jel minden mintában 100 alatt volt. Megnyugtató, hogy a főkomponens-elemzés során a mintákat a differenciálás különböző szakaszaiba csoportosítják (S1 ábra, alátámasztó információk). A statisztikai elemzéshez a mintákat preadipocitákba (n = 3), korai differenciálódásba (n = 3), köztes fenotípusba (n = 2) és érett adipocitákba (n = 3) csoportosítottuk expressziós profilok szerint (alátámasztó információk). A Keresztgén Hibamodell által becsült varianciákat tovább használtuk a statisztikai teszteléshez. Az adatokat a Proteomics identifications database (pride) (ID PXD012476) és a GSE123385 földrajzi adatkészletekbe helyezték el.
összesen 14372-ből 22277 vizsgált átiratot expresszáltunk SGBS sejtekben a differenciálódás bármely pontján, 9346 egyedi fehérjét kódolva. Ezek közül 1520-at fehérje szinten is számszerűsítettek (S2 táblázat, alátámasztó információk). 313 gén (3,3%), amelyet 404 (2,8%) transzkriptum képvisel, expressziós változásai >ötszörösek voltak az adipocita differenciálódás során (S3 táblázat, alátámasztó információk). A korrelációs elemzések azt mutatták, hogy a fehérje szintű szabályozás nagymértékben megfelelt a transzkriptom szintjének, összehasonlítva az adipocitákat a preadipocitákkal (S2 ábra, alátámasztó információk).
ezután elemeztük a tipikus adipocita marker expressziót az adipogenezis során transzkriptom és proteom szinten a differenciálódás molekuláris aláírásának robusztusságának tesztelésére. Az adiponektin expressziójában részt vevő fehérjék, a koleszterinszintézis (acetil‐CoA acetiltranszferáz, lipáz E), az aminosav‐metabolizmus (aminoaciláz), valamint a lipogenezisben és a lipolízisben részt vevő tényezők (acetil-CoA karboxiláz, stb.) szabályozását találtuk (acaca, acacb)). Emellett az érett adipocyták tipikus markereit, mint az LPL, a zsírsav‐kötő protein 4 (FABP4), a zsírsav-szintáz (FASN), a sztearoil-CoA deszaturáz és az APOE szabályozták. Ezzel szemben a karboxipeptidáz A1, 2 és 4 inhibitora, a latexin (LXN) szabályozását csökkentették. Azonosítottuk a három preadipocita markert, az LXN‐t, a Gata‐6 transzkripciós faktort (GATA6) és a C‐X-C motívum kemokin 6-ot (CXCL6), valamint a négy érett adipocita markert, az LPL-t, az ACACB-t, az APOE-t és az ATP-citrát-liázt (ACLY) (S3 ábra, alátámasztó információk).
a marker génexpressziós profilok validálásához és a legmagasabb adipocita állapot előrejelzési képességgel rendelkezők azonosításához TaqMan RT‐PCR-t végeztünk három független sgbs differenciálási kísérletben (alátámasztó információk). Az SGBS sejtekben mind a hét marker gén génexpressziós profilját validáltuk, és szignifikáns szabályozást mutattunk az SGBS differenciálódás során. Az SGBS sejtekben QPCR-rel validált öt marker gént szintén ugyanabba az irányba szabályoztuk proteom szinten (3.ábra). Az acacb, az acil, az ADIPOQ és az APOE szignifikánsan emelkedett az érett adipocitákban, míg az LXN jelentősen csökkent.
összességében az SGBS adipociták kulcsfontosságú tulajdonságokat és kulcsfontosságú fehérje-és mRNS-aláírásokat mutatnak az elsődleges emlős adipocitákban, például morfológiai jellemzőket, valamint olyan molekuláris jellemzőket, mint a PPARy útvonal aktiválása. Itt megmutatjuk, hogy számos tipikus adipokin (például ADIPOQ) és érett adipocita markerek (például LPL, FABP4, FASN) expressziója is indukálódik az SGBS sejtdifferenciálásában. Ezenkívül a kapott adatok metabolikus programozást mutatnak az adipogenezis során, a lipid anyagcserével kapcsolatos utak a leginkább érintettek.
arra számítunk, hogy az itt bemutatott proteomikai és transzkriptomikai adatok érdekesek lesznek az SGBS sejtek, mint jól jellemzett adipocita differenciálódási Modellrendszer további alkalmazásához és létrehozásához, valamint a marker gének azonosításához, amelyek felhasználhatók az emberi zsírszövet biopsziák összetételének és differenciálódási állapotának jellemzésére. Adataink megkönnyíthetik és irányíthatják a jövőbeni tanulmányokat, amelyek az adipogenezis és az emberi adipocita aláírások szabályozására összpontosítanak.