Obesidade e comorbidades associadas, por exemplo, diabetes, hipertensão e doenças cardiovasculares representam os mais comuns riscos para a saúde em todo o mundo e a prevalência mais do que dobrou nos últimos 35 anos e já surgiu na infância. Biologicamente, para que a massa gorda se acumule além da proliferação, a diferenciação de células precursoras de fibroblastos (preadipócitos) em adipócitos maduros cheios de lípidos é um processo importante de expansão dos tecidos. Assim, a compreensão dos eventos moleculares neste processo de desenvolvimento adipocitário, diferenciação e biologia é de crescente importância.
Preadipocyte linhas de células, tais como murino 3T3‐L1, primário ou adipócitos de ratos, ratos e seres humanos servem como modelos experimentais para o ser humano adipogênese e são amplamente utilizados para caracterizar adipogenic reguladores e, assim, fornecer substancial insights sobre os processos moleculares que regulam adipogênese. No entanto, existem algumas restrições sobre a generalização da fisiologia da adipogênese humana, como por exemplo, células 3T3‐L1 são espontaneamente imortalizados fibroblastos embrionários aneuplóides e eles são derivados do rato. Por outro lado, os preadipócitos humanos primários não podem ser expandidos para números elevados de células sem perder a sua capacidade de diferenciar-se em adipócitos adultos. Além disso, existe um elevado grau de variabilidade interindividual para culturas transitórias a partir de células de indivíduos, o que limita a generalizabilidade.
em 2001, foi estabelecida uma linha celular pré–adipocitária humana derivada de um rapaz com a síndrome de Simpson–Golabi-Behmel (SGBS), que demonstrou ser um sistema modelo adequado para estudos in vitro em pesquisa de adipócitos. Os preadipócitos SGBS são de origem humana, diplóides, diferenciam-se num meio livre do soro, quimicamente padronizado, e permitem experiências reprodutíveis, uma vez que o número de células pode ser aumentado em grande parte, enquanto as células mantêm a sua boa capacidade de diferenciação por mais de 30 gerações. O modelo SGBS tem sido usado em vários estudos, tais como testes farmacológicos, influências genéticas na biologia adipocitária, e adipogênese ou a caracterização de adipocinas. Como prova de princípio, os perfis de expressão de genes como GLUT4, leptina, ou lipoproteína lipase (LPL) na diferenciação de preadipócitos SGBS têm sido mostrados para se assemelhar aqueles para préadipócitos humanos primários a partir de biópsias de tecido adiposo. Contudo, ainda não foi efectuada uma comparação qualitativa das proteínas secretadas dos PREADIPÓCITOS SGBS e dos adipócitos sgbs diferenciados.
aqui realizamos uma análise abrangente sobre o perfil de proteína e expressão das células SGBS durante o curso temporal da diferenciação adipocitária. A fim de caracterizar a diferenciação adipocitária no nível proteoma e transcriptoma, as células dos PREADIPÓCITOS SGBS humanos foram diferenciadas conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os preadipócitos SGBS subcontratados foram diferenciados em DMEM/Ham’s F12 contendo biotina de 33 µm, pantotenato de 17 µm, 10 µg de apo‐transferrina, insulina de 20 nm, hidrocortisona de 10 nm e triiodotiroxina de 0,2 nm durante 10 dias. Nos primeiros 4 dias de diferenciação, o meio foi adicionalmente suplementado com dexametasona de 25 nm, isobutil‐metilxantina de 500 µm e rosiglitazona de 2 µm (para informação detalhada, ver informação de apoio).
para a análise do proteoma, utilizámos um rótulo isotópico estável em cultura celular (SILAC) combinado com CL‐MS/MS para uma análise quantitativa precisa em profundidade do proteoma de proteínas intracelulares e secretadas, como descrito anteriormente. Todas as experiências foram realizadas em triplicados biológicos.
identificámos 3737 proteínas intracelulares das quais 2602 foram quantificadas de forma fiável em pelo menos duas das três réplicas biológicas. Em análise secretome, 390 proteínas foram identificadas, das quais 39 incluem reguladores adipogénicos estabelecidos e moduladores, tais como apolipoproteína e (APOE) e adiponectina (ADIPOQ) foram quantificados. No geral, quase metade das proteínas intracelulares e extracelulares foram expressas diferentemente durante a diferenciação adipocitária (figura 1A).
a análise da localização subcelular das proteínas de acordo com a anotação da base de dados GO (gene ontology) mostrou o enriquecimento das proteínas citoplasmáticas, mas também das proteínas nucleares e mitocondriais (figura 1B). Determinaram-se que 1135 proteínas intracelulares e 18 proteínas secretadas estavam significativamente regulamentadas com uma alteração log2 vezes superior a >0.5 e um valor p <0,01 (ensaio T de duas caudas com variância desigual) (figura 1C, quadro S1, informações de apoio).
todas as proteínas regulamentadas foram agrupadas de acordo com os processos biológicos anotados do GO e vias canónicas, bem como com a sua atribuição a vias metabólicas, como fornecido pela Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG). A maioria das proteínas regulamentadas está envolvida em vias metabólicas, por exemplo, ciclo tricarboxílico e cadeia respiratória mitocondrial, bem como beta‐oxidação de ácidos gordos (figura 2A). A análise das funções proteicas moleculares mostrou um enriquecimento das proteínas de ligação Poli(A) ao ARN, das proteínas de interacção célula‐célula à base de cadherina, das oxidorredutases, das proteínas ribossómicas e das proteínas de ligação à actina (figura 2B). A análise da via KEGG das proteínas expressas diferencialmente revelou que o metabolismo dos aminoácidos, a respiração celular e o metabolismo dos ácidos gordos estavam entre os mais significativamente regulamentados (figura 2C). Várias proteínas envolvidas na Via sinalizadora activada pelo proliferador de peroxissomas (PPARy) foram sub‐regulamentadas, como descrito anteriormente. Em conjunto, a diferenciação dos adipócitos é acompanhada por um grande grau de expressão proteica diferencial, sendo as vias relacionadas com o metabolismo dos lípidos e aminoácidos as mais afectadas.
para uma análise abrangente do proteoma em relação ao transcriptoma, analisamos ainda mais o perfil de expressão do gene durante a adipogênese por uma análise de expressão de Affymetrix GeneChip. Para isso, 5 µg de RNA total foram processados para análise de microarray. Transcrição reversa, transcrição in vitro, fragmentação e hibridação das amostras foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras foram hibridizadas em Hg U133A 2.0 arrays. A digitalização e o primeiro processamento de dados foram executados com o software operacional GeneChip. Os ficheiros de intensidade da célula de amostra (CEL) foram importados para o GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) using the RMA algorithm for raw data processing. Cada gene em cada matriz foi normalizado para a mediana de todas as medições desse gene. Um gene foi geralmente considerado como não Expresso quando o sinal de expressão bruta foi inferior a 100 em todas as amostras. Tranquilizadoramente, na análise principal dos componentes, As amostras são agrupadas em diferentes fases de diferenciação (figura S1, informações de apoio). Para a análise estatística, as amostras foram agrupadas em preadipócitos (n = 3), diferenciação precoce (n = 3), fenótipo intermediário (n = 2) e adipócitos maduros (n = 3) de acordo com perfis de expressão (informação de suporte). As variâncias estimadas pelo modelo de erro de genes cruzados foram usadas para testes estatísticos. Os dados foram depositados na Base de dados de identificações Proteómica (PRIDE) (ID PXD012476) e nos conjuntos de dados GEO GSE123385.
no total 14372 de 22277 transcrições testadas foram expressas em células SGBS em qualquer momento de diferenciação, codificando para 9346 proteínas únicas. 1520 destas foram quantificadas também ao nível das proteínas (quadro S2, informações de apoio). 313 genes (3,3%) representados por 404 (2,8%) transcrições tiveram mudanças de expressão >fivefold durante a diferenciação adipocitária (tabela S3, informações de suporte). As análises de correlação revelaram que a regulação ao nível das proteínas correspondia fortemente ao nível dos transcriptomas, comparando os adipócitos com os preadipócitos (figura S2, informações de apoio).
a seguir, analisamos a expressão típica dos marcadores adipócitos durante a adipogénese ao nível da transcriptoma e do proteoma para testar a robustez da assinatura molecular da diferenciação. Encontrámos uma regulação das proteínas envolvidas na expressão da adiponectina, síntese de colesterol (acetil‐CoA acetiltransferase, lipase e), metabolismo dos aminoácidos (aminoacilase) e de factores envolvidos na lipogénese e lipólise (acetil‐CoA carboxilase α e β (ACACA, ACACB)). Adicionalmente, os marcadores típicos dos adipócitos maduros, como LPL, proteína de ligação de ácidos gordos 4 (FABP4), ácido gordo sintase (FASN), estearoil‐CoA desaturase e APOE, foram aumentados. Em contraste, observou-se que a latexina (LXN), um inibidor da carboxipeptidase A1, 2 e 4, estava desprovida de regulamentação. Identificamos três preadipocyte marcadores, LXN, fator de transcrição GATA‐6 (GATA6), e C‐X‐C motif quimiocinas 6 (CXCL6), e os quatro maduro adipócito marcadores de LPL, ACACB, APOE, e o ATP citrato liase (ACLY) (Figura S3, Informação de Apoio).
a fim de validar os perfis de expressão do gene marcador e identificar aqueles com a maior capacidade de previsão do estado adipócito, realizamos TaqMan RT‐PCR em três experimentos independentes de diferenciação SGBS (informações de apoio). Nas células SGBS, fomos capazes de validar os perfis de expressão genética de todos os sete genes marcadores e mostrou uma regulação significativa durante a diferenciação SGBS. Cinco genes marcadores validados com qPCR nas células SGBS foram também regulados na mesma direcção ao nível do proteoma (Figura 3). ACACB, acil, ADIPOQ e APOE foram significativamente regulados em adipócitos maduros, enquanto LXN foi significativamente reduzido.
em conjunto, os adipócitos SGBS exibem características chave e assinaturas chave de proteínas e mRNA de adipócitos mamíferos primários, por exemplo, características morfológicas, bem como características moleculares, como a ativação da via PPARy. Aqui, mostramos que também a expressão de várias adipocinas típicas (por exemplo, ADIPOQ) e marcadores adipocíticos maduros (por exemplo, LPL, FABP4, FASN) são induzidos na diferenciação celular SGBS. Além disso, os dados obtidos revelam uma programação metabólica durante a adipogénese, sendo as vias relacionadas com o metabolismo lipídico as mais afectadas.
esperamos que a proteômica e a transcriptomics dados aqui apresentados serão de interesse para a continuação da aplicação e criação de PECS células como um bem‐caracteriza-se o modelo de sistema para a diferenciação do adipócito, bem como para a identificação de marcador de genes, que podem ser usados para caracterizar a gordura humana biópsias de tecido, em termos de composição e diferenciação do estado. Nossos dados podem facilitar e orientar futuros estudos focados na regulação da adipogênese e assinaturas de adipócitos humanos.