Obezity a souvisejících komorbidit, například, diabetu, hypertenze a kardiovaskulární onemocnění představují nejčastější zdravotní rizika po celém světě a prevalence má více než zdvojnásobil v posledních 35 letech a objevily již v dětství. Biologicky, aby se tuková hmota akumulovala kromě proliferace, je diferenciace prekurzorů podobných fibroblastům (preadipocyty) na zralé adipocyty naplněné lipidy hlavním procesem expanze tkáně. Proto, porozumění molekulárním událostem v tomto procesu vývoje, diferenciace, a biologie má rostoucí význam.
Preadipocyte buněčných linií, jako jsou myších 3T3‐L1, nebo primárních adipocytů z myši, krysy nebo lidé sloužit jako experimentální modely pro lidské adipogenesis a jsou široce používány charakterizovat adipogenic regulátory, a tím poskytují značné nahlédnutí do molekulární procesy regulace adipogenesis. Nicméně, tam jsou některé omezení na generalizability k fyziologii lidského adipogenesis, jako například 3T3‐L1 buňky jsou spontánně zvěčněn aneuploidní embryonální fibroblasty a jsou odvozeny od myši. Na druhé straně primární lidské preadipocyty nemohou být rozšířeny na vysoký počet buněk, aniž by ztratily schopnost diferencovat se na zralé adipocyty. Dále existuje vysoký stupeň interindividuální variability pro přechodné kultury z buněk jedinců, což omezuje zobecnitelnost.
V roce 2001, lidské preadipocyte buněčné linie odvozené od chlapce s Simpson–Golabi–Behmel syndrom (SGBS) byla založena, který se ukázal jako vhodný modelový systém pro in vitro studium v adipocyte výzkumu. SGBS preadipocytes jsou lidského původu, diploidní, rozlišovat v séru zdarma, chemicky standardizované médium, a umožňují reprodukovatelné experimenty jako mobilní čísla mohou být do značné míry zvýšila, zatímco buňky udržet jejich dobrou diferenciaci kapacitu pro více než 30 generací. Model SGBS byl použit pro řadu studií, jako je farmakologické testování, genetické vlivy na biologii adipocytů a adipogeneze nebo charakterizace adipokinů. Jako důkaz principu, výraz profily genů jako GLUT4, leptin, nebo lipoproteinové lipázy (LPL) v rozlišení SGBS preadipocytes bylo prokázáno, že se podobají těm pro primární lidské preadipocytes z tukové tkáně biopsie. Kvalitativní srovnání proteinů vylučovaných z PREADIPOCYTŮ SGBS a diferencovaných adipocytů SGBS však dosud nebylo provedeno.
Zde jsme provedli komplexní analýzu bílkovin a vyjádření profil SGBS buněk během časového průběhu diferenciace adipocytů. Za účelem charakterizace diferenciace adipocytů na úrovni proteomu a transkriptomu byly buňky PREADIPOCYTŮ lidských SGBS diferencovány, jak bylo popsáno výše. Krátce, subconfluent SGBS preadipocytes byly rozlišeny v DMEM/Ham ‚ s F12 obsahující 33 µm biotin, 17 µm pantothenát, 10 µg mL apo‐transferin, 20 nm inzulínu, 10 nm, hydrokortizon, a 0,2 nm triiodothyroxine dobu 10 dnů. Pro první 4 dny diferenciace bylo médium dodatečně doplněno 25 nm dexamethasonem, 500 µm isobutyl‐methylxanthinem a 2 µm rosiglitazonem (podrobné informace viz podpůrné informace).
Pro analýzu proteomu, jsme použili Stabilní Izotopové Značení v Buněčné Kultuře (SILAC) v kombinaci s LC‐MS/MS pro přesné hloubkové kvantitativní analýza proteomu intracelulární a sekretovaný proteiny, jak bylo popsáno dříve. Všechny experimenty byly prováděny v biologických triplikátech.
identifikovali Jsme 3737 intracelulární proteiny, které 2602 byly spolehlivě kvantifikovat alespoň ve dvou ze tří biologických replikátů. V secretome analýzy, 390 proteiny byly identifikovány, z nichž 39 proteinů zahrnutých založena adipogenic regulátory a modulátory jako je apolipoprotein E (APOE) a adiponectin (ADIPOQ) byly kvantifikovány. Celkově byla téměř polovina intracelulárních a extracelulárních proteinů diferencovaně exprimována během diferenciace adipocytů (obrázek 1A).
analýza buněčné lokalizace proteinů, podle (gene ontology) databáze anotace ukázala obohacení cytoplazmatické proteiny, ale také z jaderných a mitochondriálních proteinů (Obrázek 1B). Bylo zjištěno, že 1135 intracelulárních proteinů a 18 sekretovaných proteinů je významně regulováno log2 násobnou změnou >0.5 a p‐hodnota <0,01 (dvouocasý t-test s nerovným rozptylem) (obrázek 1C, tabulka S1, podpůrné informace).
Všechny regulované proteiny byly seskupeny podle komentovaný JÍT biologických procesů a kanonické cesty, jakož i jejich přiřazení k metabolické dráhy, jak je stanoveno v Kjótském encyklopedie genů a genomů (KEGG). Většina regulovaných proteinů se podílí na metabolických drahách, například trikarboxylovém cyklu a mitochondriálním respiračním řetězci,stejně jako beta‐oxidaci mastných kyselin (obrázek 2A). Analýza molekulární bílkoviny funkce ukázal obohacením poly(A) RNA vazebné proteiny, cadherin‐založené mobilní‐buněčné interakce proteinů, oxidoreduktázy, ribozomální proteiny, aktin vazebné proteiny (Obrázek 2B). Analýza dráhy Kegg odlišně exprimovaných proteinů odhalila, že metabolismus aminokyselin, buněčné dýchání a metabolismus mastných kyselin patří mezi nejvýznamnější regulované (obrázek 2C). Několik proteinů zapojených do peroxisome tiazolidindionom‐aktivované receptory (PPARy) signální dráhy byly upregulovány, jak bylo popsáno dříve. Společně je diferenciace adipocytů doprovázena velkým stupněm diferenciální exprese proteinů, přičemž dráhy metabolismu lipidů a aminokyselin jsou nejvíce postiženy.
Pro komplexní analýzu proteomu v souvislosti s transcriptome, dále jsme analyzovali genovou expresi profil během adipogenesis pomocí Affymetrix GeneChip Výraz Analýzy. Za tímto účelem bylo zpracováno 5 µg celkové RNA pro analýzu mikroarray. Reverzní transkripce, in vitro transkripce, fragmentace a hybridizace vzorků byly provedeny podle doporučení výrobce. Vzorky byly hybridizovány na pole Hg u133a 2.0. Skenování a první zpracování dat bylo provedeno pomocí operačního softwaru GeneChip. Soubory sample cell intensity (cel) byly importovány do GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) pomocí algoritmu RMA pro zpracování surových dat. Každý gen na každém poli byl normalizován na medián všech měření tohoto genu. Gen byl obecně považován za neexprimovaný, když byl surový expresivní signál ve všech vzorcích nižší než 100. Konejšivě, analýza hlavních komponent, vzorky jsou seskupeny do různých fází diferenciace (Obrázek S1, Podpůrné Informace). Pro statistické analýzy byly vzorky rozděleny do preadipocytes (n = 3), časné diferenciace (n = 3), středně fenotyp (n = 2), a zralé adipocyty (n = 3) podle vyjádření profily (Podpůrné Informace). Odchylky odhadované křížovým genovým chybovým modelem byly dále použity pro statistické testování. Údaje byly uloženy v Proteomika identifikace databáze (PÝCHA) (ID PXD012476) a GEO datových sad GSE123385.
celkem 14372 z 22277 testovaných transkriptů bylo exprimováno v SGBS buňkách v libovolném časovém bodě diferenciace, kódující 9346 jedinečných proteinů. 1520 z nich bylo kvantifikováno také na úrovni bílkovin (tabulka S2, podpůrné informace). 313 genů (3,3%) reprezentovaných 404 (2,8%) transkripty mělo během diferenciace adipocytů pětinásobné změny exprese >(tabulka S3, podpůrné informace). Korelační analýzy odhalily, že regulace na úrovni proteinu vysoce odpovídala úrovni transkriptomu srovnávající adipocyty s preadipocyty (obrázek S2, podpůrné informace).
dále jsme analyzovali typickou expresi markerů adipocytů během adipogeneze na úrovni transkriptomu a proteomu pro testování robustnosti molekulárního podpisu diferenciace. Našli jsme upregulace proteiny zapojené v adiponektinu exprese, syntézy cholesterolu (acetyl‐CoA acetyltransferázu, lipázy E), metabolismu aminokyselin (aminoacylase), a faktory, které se podílejí lipogenezí a lipolýzou (acetyl‐CoA carboxylase α a β (ACACA, ACACB)). Navíc, typické znaky zralých adipocytů jako LIPOPROTEINY, mastné kyseliny vázající protein 4 (FABP4), syntázu mastných kyselin (FASN), stearoyl‐CoA desaturase a APOE byly upregulovány. Naproti tomu bylo pozorováno snížení hladiny latexinu (LXN), inhibitoru karboxypeptidázy A1, 2 a 4. Identifikovali jsme tři preadipocyte značky, LXN, transkripční faktor GATA‐6 (GATA6), a C‐X‐C motif chemokinový 6 (CXCL6), a čtyři zralých adipocytů značky LPL, ACACB, APOE, a ATP citrát lyázy (ACLY) (Obrázek S3, Podpůrné Informace).
Za účelem ověření markerů genové exprese profily a identifikovat ty s nejvyšší adipocytů stav predikční schopnost, provedli jsme TaqMan RT‐PCR ve třech nezávislých SGBS diferenciace experimenty (Podpůrné Informace). V SGBS buňkách jsme byli schopni ověřit profily genové exprese všech sedmi markerových genů a vykazovali významnou regulaci během diferenciace SGBS. Pět markerových genů validovaných pomocí qPCR v buňkách SGBS bylo také regulováno stejným směrem na úrovni proteomu (obrázek 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ a APOE byly významně upregulovány ve zralých adipocytech, zatímco LXN byl významně downregulován.
dohromady SGBS adipocyty vykazují klíčové vlastnosti a klíčové protein a mRNA podpisy primární savců adipocyty, například morfologické charakteristiky, stejně jako molekulární znaky, jako je aktivace PPARy dráhy. Zde ukazujeme, že také exprese několika typických adipokinů (např. ADIPOQ) a zralých markerů adipocytů (např. LPL, FABP4, FASN) jsou indukovány v diferenciaci SGBS buněk. Získaná data navíc odhalují metabolické programování během adipogeneze, přičemž dráhy metabolismu lipidů jsou nejvíce ovlivněny.
očekáváme, že proteomika a transcriptomics údaje zde uvedené, aby být zajímavé pro další aplikace a vytvoření SGBS buňky jako dobře charakterizován modelový systém pro diferenciaci adipocytů, stejně jako pro identifikaci markerových genů, které mohou být použity k charakterizují lidské tukové tkáně biopsie, pokud jde o složení a diferenciace státu. Naše data mohou usnadnit a vést budoucí studie zaměřené na regulaci adipogeneze a podpisů lidských adipocytů.