Fedme og tilhørende komorbiditet, for eksempel diabetes, hypertensjon og kardiovaskulære sykdommer, representerer de vanligste helserisikoen over hele verden, og forekomsten har mer enn doblet seg de siste 35 årene og allerede oppstått i barndommen. Biologisk, for at fettmassen skal akkumuleres i tillegg til proliferasjon, er differensiering av fibroblastlignende forløperceller (preadipocytter) i lipidfylte modne adipocytter en viktig prosess for vevsutvidelse. Derfor er forståelsen av molekylære hendelser i denne prosessen med adipocyttutvikling, differensiering og biologi av økende betydning.
Preadipocyte cellelinjer, som murine 3T3-L1, eller primære adipocytter fra mus, rotter eller mennesker tjener som eksperimentelle modeller for menneskelig adipogenese og er mye brukt til å karakterisere adipogene regulatorer og dermed gi betydelig innsikt i molekylære prosesser som regulerer adipogenese. Likevel er det noen begrensninger på generaliserbarheten til fysiologien av human adipogenese, for EKSEMPEL er 3t3-L1-celler spontant immortalized aneuploid embryonale fibroblaster og de er avledet fra mus. På den annen side kan primære humane preadipocytter ikke utvides til høye celle tall uten å miste sin evne til å skille seg inn i modne adipocytter. Videre er det høy grad av inter-individuell variabilitet for forbigående kulturer fra celler av individer, og dermed begrense generaliserbarhet.
i 2001 ble det etablert en human preadipocyttcellelinje avledet fra en gutt Med Simpson–Golabi–Behmel-syndromet (Sgbs), som ble vist å være et egnet modellsystem for in vitro-studier i adipocytforskning. SGBS preadipocytter er av menneskelig opprinnelse, diploide, differensierer i et serumfritt, kjemisk standardisert medium, og tillater reproduserbare eksperimenter da celletallene i stor grad kan økes mens cellene beholder sin gode differensieringskapasitet i mer enn 30 generasjoner. SGBS-modellen har blitt brukt til en rekke studier, for eksempel farmakologisk testing, genetisk påvirkning på adipocyttbiologi og adipogenese eller karakterisering av adipokiner. Som bevis på prinsippet har uttrykksprofilene til gener som GLUT4, leptin eller lipoprotein lipase (LPL) ved differensiering AV sgbs preadipocytter vist seg å ligne de for primære humane preadipocytter fra fettvevsbiopsier. En kvalitativ sammenligning av proteiner utskilt fra sgbs preadipocytter og differensierte sgbs adipocytter er imidlertid ennå ikke utført.
her utførte vi en omfattende analyse av protein-og ekspresjonsprofilen TIL sgbs-celler i løpet av adipocytdifferensieringen. For å karakterisere adipocyttdifferensiering på proteom-og transkriptomnivå ble humane sgbs preadipocytter-celler differensiert som beskrevet tidligere. I korte trekk ble sgbs preadipocytter fra subkontinentet differensiert i DMEM/Hams F12 som inneholdt 33 µ biotin, 17 µ pantothenat, 10 µ mL apo‐transferrin, 20 nm insulin, 10 nm hydrokortison og 0,2 nm trijodtyroksin i 10 dager. For de første 4 dagene med differensiering ble mediet i tillegg supplert med 25 nm deksametason, 500 µ isobutyl-metylxanthin og 2 µ rosiglitazon (for detaljert informasjon, se Støtteinformasjonen).
For proteomanalysen brukte Vi Stabil Isotopmerking i Cellekultur (SILAC) kombinert MED LC-MS / MS for en nøyaktig dybdegående kvantitativ proteomanalyse av intracellulære og utskillede proteiner som beskrevet tidligere. Alle eksperimenter ble utført i biologiske triplikater.
vi identifiserte 3737 intracellulære proteiner, hvorav 2602 var pålitelig kvantifisert i minst to av de tre biologiske replikatene. I secretome analyse ble 390 proteiner identifisert, hvorav 39 proteiner inkluderte etablerte adipogene regulatorer og modulatorer som apolipoprotein E (APOE) og adiponektin (ADIPOQ) ble kvantifisert. Totalt sett ble nesten halvparten av de intracellulære og ekstracellulære proteinene differensielt uttrykt under adipocyttdifferensiering (Figur 1a).
analysen av den subcellulære lokaliseringen av proteiner I HENHOLD TIL GO-databasen (gene ontology) viste anrikning av cytoplasmatiske proteiner, men også av nukleare og mitokondrielle proteiner (Figur 1b). 1135 intracellulære proteiner og 18 utskillede proteiner ble bestemt å være signifikant regulert med en log2-foldsendring på > 0.5 og en p‐verdi på <0,01 (to tailed t-test med ulik varians) (Figur 1C, Tabell S1, Støtteinformasjon).
alle regulerte proteiner ble gruppert i henhold TIL DE annoterte GO biologiske prosesser og kanoniske veier, samt til deres tildeling til metabolske veier som gitt Av Kyoto encyclopedia of genes and genomes (Kegg). Flertallet av de regulerte proteinene er involvert i metabolske veier, for eksempel tricarboxylsyklus og mitokondriell respiratorisk kjede, samt fettsyre beta-oksidasjon (Figur 2a). Analyse av molekylære proteinfunksjoner viste en anrikning av poly (A) RNA‐bindende proteiner, cadherinbaserte celle‐celle-interaksjonsproteiner, oksidoreduktaser, ribosomale proteiner og aktinbindende proteiner (Figur 2b). KEGG pathway analyse av differensielt uttrykte proteiner viste at aminosyremetabolismen, celleåndingen og fettsyremetabolismen var blant de mest signifikant regulerte (Figur 2c). Flere proteiner involvert i signalveien peroksisomproliferatoraktivert mottakelig (PPARy) ble oppregulert, som beskrevet tidligere. Til sammen er differensiering av adipocytter ledsaget av en stor grad av differensial proteinuttrykk med lipid og aminosyre metabolisme relaterte veier som er de mest berørte.
For en omfattende analyse av proteomet i forhold til transkriptomet, analyserte vi videre genuttrykksprofilen under adipogenese ved En Affymetrix GeneChip-Uttrykksanalyse. For dette ble 5 µ av totalt RNA behandlet for mikroarray-analyse. Omvendt transkripsjon, in vitro transkripsjon, fragmentering og hybridisering av prøvene ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Prøver ble hybridisert TIL HG U133A 2.0 arrays. Skanning og første databehandling ble utført Med GeneChip operativ programvare. Cel-filene (sample cell intensity) ble importert Til GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, USA) ved HJELP AV rma-algoritmen for rå databehandling. Hvert gen på hver matrise ble normalisert til medianen av alle målinger av det genet. Et gen ble generelt ansett som ikke uttrykt når råuttrykkssignalet var under 100 i alle prøver. Betryggende, i hovedkomponentanalyse, er prøver gruppert i forskjellige stadier av differensiering (Figur S1, Støttende Informasjon). For statistisk analyse ble prøvene gruppert i preadipocytter (n = 3), tidlig differensiering (n = 3), intermediær fenotype (n = 2) og modne adipocytter (n = 3) i henhold til uttrykksprofiler (Støtteinformasjon). Variansene estimert Av Kryssgenfeilmodellen ble videre brukt til statistisk testing. Data ble deponert I Proteomics identifications database (PRIDE) (ID PXD012476) OG GEO datasett GSE123385.
totalt 14372 av 22277 testede transkripsjoner ble uttrykt I SGBS-celler på et hvilket som helst tidspunkt for differensiering, koding for 9346 unike proteiner. 1520 av disse ble også kvantifisert på proteinnivå (Tabell S2, Støttende Informasjon). 313 gener (3,3%) representert ved 404 (2,8%) transkripsjoner hadde uttrykksendringer >femdoblet under adipocyttdifferensiering (Tabell S3, Støtteinformasjon). Korrelasjonsanalyser viste at regulering på proteinnivået i høy grad tilsvarte transkriptomnivået som sammenlignet adipocytter med preadipocytter (Figur S2, Støttende Informasjon).
deretter analyserte vi typisk adipocyte markøruttrykk under adipogenese på transkriptom og proteom nivå for å teste robustheten av molekylær signatur av differensiering. Vi fant en oppregulering av proteiner involvert i adiponektinuttrykk, kolesterolsyntese (acetyl‐CoA acetyltransferase, lipase E), aminosyremetabolisme (aminoacylase) og faktorer involvert i lipogenese og lipolyse (acetyl‐CoA karboksylase α og β (ACACA, ACACB)). I tillegg ble typiske markører for modne adipocytter som LPL, fettsyrebindende protein 4 (FABP4), fettsyresyntase (FASN), stearoyl‐CoA desaturase og APOE oppregulert. I kontrast ble latexin (LXN), en hemmer av karboksypeptidase A1, 2 og 4, observert å bli nedregulert. Vi identifiserte de tre preadipocyttmarkørene, lxn, transkripsjonsfaktor GATA-6 (GATA6) og C-X-C motif chemokine 6 (CXCL6), og de fire modne adipocyttmarkørene LPL, ACACB, APOE og ATP citrate lyase (ACLY) (Figur S3, Støttende Informasjon).
for å validere markør genuttrykk profiler og for å identifisere de med høyest adipocyte status prediksjon evne, utførte Vi TaqMan RT‐PCR i tre uavhengige sgbs differensiering eksperimenter (Støtte Informasjon). I sgbs-celler var vi i stand til å validere genuttrykksprofilene til alle syv markørgener og viste en signifikant regulering under sgbs differensiering. Fem markørgener validert med qPCR i sgbs-celler ble også regulert i samme retning på proteomnivået (Figur 3). ACACB, ACYL, ADIPOQ og APOE ble signifikant oppregulert i modne adipocytter, MENS LXN ble signifikant nedregulert.
Til sammen viser sgbs adipocytter nøkkelfunksjoner og nøkkelprotein og mRNA signaturer av primære pattedyrs adipocytter, for eksempel morfologiske egenskaper samt molekylære kjennetegn som aktivering av PPARy-banen. HER viser vi at også uttrykket av flere typiske adipokiner (F.eks. ADIPOQ) og modne adipocyttmarkører (F. eks. LPL, FABP4, FASN) er indusert I SGBS celledifferensiering. Videre viser de oppnådde dataene en metabolsk programmering under adipogenese, med lipidmetabolismerelaterte veier som er mest berørt.
vi forventer at proteomikk-og transkriptomikkdataene som presenteres her, er av interesse for videre anvendelse og etablering av sgbs‐celler som et godt karakterisert modellsystem for adipocytdifferensiering, samt for identifisering av markørgener, som kan brukes til å karakterisere humane fettvevsbiopsier i form av sammensetning og differensieringstilstand. Våre data kan lette og veilede fremtidige studier med fokus på regulering av adipogenese og humane adipocytt signaturer.