L’obésité et les comorbidités associées, par exemple le diabète, l’hypertension et les maladies cardiovasculaires, représentent les risques pour la santé les plus courants dans le monde et la prévalence a plus que doublé au cours des 35 dernières années et est déjà apparue dans l’enfance. Biologiquement, pour que la masse grasse s’accumule en plus de la prolifération, la différenciation des cellules précurseurs de type fibroblaste (préadipocytes) en adipocytes matures remplis de lipides est un processus majeur d’expansion tissulaire. Par conséquent, la compréhension des événements moléculaires dans ce processus de développement, de différenciation et de biologie des adipocytes revêt une importance croissante.
Les lignées cellulaires préadipocytaires, telles que le 3T3‐L1 murin, ou les adipocytes primaires de souris, de rats ou d’humains servent de modèles expérimentaux pour l’adipogenèse humaine et sont largement utilisées pour caractériser les régulateurs adipogènes et fournir ainsi des informations substantielles sur les processus moléculaires régulant l’adipogenèse. Néanmoins, il existe certaines contraintes sur la généralisabilité à la physiologie de l’adipogenèse humaine, comme par exemple, les cellules 3T3‐L1 sont des fibroblastes embryonnaires aneuploïdes immortalisés spontanément et elles sont dérivées de souris. D’autre part, les préadipocytes humains primaires ne peuvent pas être étendus à un nombre élevé de cellules sans perdre leur capacité à se différencier en adipocytes matures. De plus, il existe un degré élevé de variabilité interindividuelle pour les cultures transitoires à partir de cellules d’individus, limitant ainsi la généralisabilité.
En 2001, une lignée cellulaire préadipocytaire humaine dérivée d’un garçon atteint du syndrome de Simpson–Golabi–Behmel (SGBS) a été établie, ce qui s’est avéré être un système modèle approprié pour les études in vitro dans la recherche sur les adipocytes. Les préadipocytes SGBS sont d’origine humaine, diploïdes, se différencient dans un milieu exempt de sérum, normalisé chimiquement, et permettent des expériences reproductibles car le nombre de cellules peut être largement augmenté tandis que les cellules conservent leur bonne capacité de différenciation pendant plus de 30 générations. Le modèle SGBS a été utilisé pour de nombreuses études, telles que les tests pharmacologiques, les influences génétiques sur la biologie des adipocytes et l’adipogenèse ou la caractérisation des adipokines. Comme preuve de principe, il a été démontré que les profils d’expression de gènes tels que la GLUT4, la leptine ou la lipoprotéine lipase (LPL) dans les préadipocytes SGBS différenciants ressemblent à ceux des préadipocytes humains primaires issus de biopsies de tissus adipeux. Une comparaison qualitative des protéines sécrétées par les préadipocytes SGBS et les adipocytes SGBS différenciés n’a cependant pas encore été réalisée.
Ici, nous avons effectué une analyse complète du profil protéique et d’expression des cellules SGBS pendant le cours temporel de la différenciation des adipocytes. Afin de caractériser la différenciation des adipocytes au niveau du protéome et du transcriptome, des cellules de préadipocytes SGBS humains ont été différenciées comme décrit précédemment. Brièvement, des préadipocytes SGBS subconfluents ont été différenciés dans le F12 de DMEM/Ham contenant 33 µm de biotine, 17 µm de pantothénate, 10 µg mL d’apo‐transferrine, 20 nm d’insuline, 10 nm d’hydrocortisone et 0,2 nm de triiodothyroxine pendant 10 jours. Pendant les 4 premiers jours de différenciation, le milieu a été additionné de dexaméthasone à 25 nm, d’isobutyl‐méthylxanthine à 500 µm et de rosiglitazone à 2 µm (pour des informations détaillées, voir Informations complémentaires).
Pour l’analyse du protéome, nous avons utilisé le marquage isotopique stable en Culture cellulaire (SILAC) combiné avec LC-MS / MS pour une analyse quantitative précise et approfondie du protéome des protéines intracellulaires et sécrétées comme décrit précédemment. Toutes les expériences ont été réalisées en triplés biologiques.
Nous avons identifié 3737 protéines intracellulaires dont 2602 ont été quantifiées de manière fiable dans au moins deux des trois répliques biologiques. Dans l’analyse du sécrétome, 390 protéines ont été identifiées dont 39 protéines comprenant des régulateurs et modulateurs adipogènes établis tels que l’apolipoprotéine E (APOE) et l’adiponectine (ADIPOQ) ont été quantifiées. Globalement, près de la moitié des protéines intracellulaires et extracellulaires ont été exprimées de manière différentielle lors de la différenciation des adipocytes (Figure 1A).
L’analyse de la localisation subcellulaire des protéines selon l’annotation de la base de données GO (gene ontology) a montré un enrichissement en protéines cytoplasmiques, mais aussi en protéines nucléaires et mitochondriales (Figure 1B). Il a été déterminé que 1135 protéines intracellulaires et 18 protéines sécrétées étaient régulées de manière significative avec un changement de pli log2 > 0.5 et une valeur p < 0,01 (test t à deux queues avec variance inégale) (Figure 1C, Tableau S1, Informations à l’appui).
Toutes les protéines régulées ont été regroupées en fonction des processus biologiques et des voies canoniques annotés GO ainsi que de leur affectation aux voies métaboliques fournies par l’encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG). La majorité des protéines régulées sont impliquées dans les voies métaboliques, par exemple le cycle tricarboxylique et la chaîne respiratoire mitochondriale, ainsi que la bêta‐oxydation des acides gras (Figure 2A). L’analyse des fonctions protéiques moléculaires a montré un enrichissement en protéines de liaison à l’ARN poly(A), en protéines d’interaction cellule‐cellule à base de cadhérine, en oxydoréductases, en protéines ribosomiques et en protéines de liaison à l’actine (Figure 2B). L’analyse de la voie de KEGG des protéines exprimées différentiellement a révélé que le métabolisme des acides aminés, la respiration cellulaire et le métabolisme des acides gras étaient parmi les plus significativement régulés (figure 2C). Plusieurs protéines impliquées dans la voie de signalisation du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARy) ont été régulées à la hausse, comme décrit précédemment. Ensemble, la différenciation des adipocytes s’accompagne d’un degré élevé d’expression différentielle des protéines, les voies liées au métabolisme des lipides et des acides aminés étant les plus touchées.
Pour une analyse complète du protéome par rapport au transcriptome, nous avons analysé plus avant le profil d’expression des gènes au cours de l’adipogenèse par une analyse d’expression de GeneChip Affymetrix. Pour cela, 5 µg d’ARN total ont été traités pour l’analyse de microréseaux. La transcription inverse, la transcription in vitro, la fragmentation et l’hybridation des échantillons ont été effectuées selon les recommandations du fabricant. Des échantillons ont été hybridés à des matrices de HG U133A 2.0. La numérisation et le premier traitement des données ont été exécutés avec le logiciel d’exploitation GeneChip. Les fichiers d’intensité de cellule d’échantillon (CEL) ont été importés dans GeneSpring GX 7.3. (Agilent, Palo Alto, États-Unis) utilisant l’algorithme RMA pour le traitement des données brutes. Chaque gène de chaque réseau a été normalisé à la médiane de toutes les mesures de ce gène. Un gène est généralement considéré comme non exprimé lorsque le signal d’expression brut est inférieur à 100 dans tous les échantillons. De façon rassurante, dans l’analyse en composantes principales, les échantillons sont regroupés en étapes distinctes de différenciation (Figure S1, Informations à l’appui). Pour l’analyse statistique, les échantillons ont été regroupés en préadipocytes (n= 3), différenciation précoce (n= 3), phénotype intermédiaire (n= 2) et adipocytes matures (n= 3) selon les profils d’expression (Informations à l’appui). Les variances estimées par le Modèle d’erreur inter-gènes ont également été utilisées pour des tests statistiques. Les données ont été déposées dans la base de données d’identifications protéomiques (PRIDE) (ID PXD012476) et les ensembles de données géographiques GSE123385.
Au total, 14372 des 22277 transcrits testés ont été exprimés dans des cellules SGBS à tout moment de la différenciation, codant pour 9346 protéines uniques. 1520 d’entre eux ont également été quantifiés au niveau des protéines (Tableau S2, Informations à l’appui). 313 gènes (3,3 %) représentés par 404 transcrits (2,8 %) présentaient des changements d’expression > quintuplés au cours de la différenciation des adipocytes (Tableau S3, Informations à l’appui). Les analyses de corrélation ont révélé que la régulation au niveau des protéines correspondait fortement au niveau du transcriptome comparant les adipocytes aux préadipocytes (Figure S2, Informations à l’appui).
Ensuite, nous avons analysé l’expression typique des marqueurs adipocytaires au cours de l’adipogenèse au niveau du transcriptome et du protéome pour tester la robustesse de la signature moléculaire de la différenciation. Nous avons trouvé une régulation à la hausse des protéines impliquées dans l’expression de l’adiponectine, la synthèse du cholestérol (acétyl‐COA acétyltransférase, lipase E), le métabolisme des acides aminés (aminoacylase), et des facteurs impliqués dans la lipogenèse et la lipolyse (acétyl‐Coa carboxylase α et β (ACACA, ACACB)). De plus, des marqueurs typiques des adipocytes matures tels que la LPL, la protéine de liaison aux acides gras 4 (FABP4), la synthase des acides gras (FASN), la désaturase de la stéaroyl‐CoA et l’APOE ont été régulés à la hausse. En revanche, la latexine (LXN), un inhibiteur de la carboxypeptidase A1, 2 et 4, a été observée comme étant régulée à la baisse. Nous avons identifié les trois marqueurs préadipocytaires, LXN, le facteur de transcription GATA-6 (GATA6) et la chimiokine 6 à motif C‐X‐C (CXCL6), et les quatre marqueurs adipocytaires matures LPL, ACACB, APOE et l’ATP citrate lyase (ACLY) (Figure S3, Informations à l’appui).
Afin de valider les profils d’expression des gènes marqueurs et d’identifier ceux qui ont la capacité de prédiction du statut adipocytaire la plus élevée, nous avons réalisé la RT‐PCR TaqMan dans trois expériences de différenciation SGBS indépendantes (Informations à l’appui). Dans les cellules SGBS, nous avons pu valider les profils d’expression génique des sept gènes marqueurs et avons montré une régulation significative lors de la différenciation SGBS. Cinq gènes marqueurs validés par qPCR dans des cellules SGBS ont également été régulés dans la même direction au niveau du protéome (Figure 3). L’ACACB, l’ACYL, l’ADIPOQ et l’APOE ont été significativement régulés à la hausse dans les adipocytes matures, tandis que le LXN a été significativement régulé à la baisse.
Pris ensemble, les adipocytes SGBS présentent des caractéristiques clés et des signatures clés de protéines et d’ARNm des adipocytes primaires de mammifères, par exemple des caractéristiques morphologiques ainsi que des caractéristiques moléculaires telles que l’activation de la voie PPARy. Ici, nous montrons que l’expression de plusieurs adipokines typiques (par exemple, ADIPOQ) et de marqueurs adipocytaires matures (par exemple, LPL, FABP4, FASN) est également induite dans la différenciation des cellules SGBS. De plus, les données obtenues révèlent une programmation métabolique au cours de l’adipogenèse, les voies liées au métabolisme lipidique étant les plus affectées.
Nous nous attendons à ce que les données protéomiques et transcriptomiques présentées ici présentent un intérêt pour l’application et l’établissement ultérieurs des cellules SGBS en tant que système modèle bien caractérisé pour la différenciation des adipocytes ainsi que pour l’identification de gènes marqueurs, qui peuvent être utilisés pour caractériser les biopsies de tissus adipeux humains en termes de composition et d’état de différenciation. Nos données peuvent faciliter et guider de futures études axées sur la régulation de l’adipogenèse et la signature des adipocytes humains.