TEXT
az arzén I. osztályú emberi rákkeltő anyag, amely egészségügyi kockázatot jelent az emberekre. Az arzén expozíció a bőrrákhoz, a húgyhólyagrákhoz, a cukorbetegséghez, a szív-és érrendszeri betegségekhez és a perifériás érbetegségekhez kapcsolódik (1, 2). Az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége (EPA) az arzént az első helyen rangsorolja a veszélyes anyagok Szuperalap-listáján (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
az arzént geotermikus tevékenység, ásványi anyagok oldódása és antropogén tevékenységek, például ipari szennyvizek, fosszilis tüzelőanyagok elégetése, valamint arzéntartalmú peszticidek, herbicidek, faanyagvédő szerek és takarmány-adalékanyagok felhasználásával szabadítják fel a környezetbe (3). Az arzénnel szennyezett öntözővíz használatának eredményeként az arzén felhalmozódik a rizsben, amely a világ népességének fele étrendi alapanyaga (4). Az arzénmetilezés méregtelenítő út (5, 6). Sok organizmusnak vannak olyan génjei, amelyek kódolják arzenit S-adenozil-metionin (SAM) metiltranszferázok (a mikrobákban ArsM-nek, a magasabb organizmusokban AS3MT-nek nevezik), amelyek biotranszformálódnak (III) metilezett fajokká, Illékony, nem mérgező trimetilarzinnal (7) mint végtermék (5, 6, 8, 9). A Pseudomonas putida egy Gram-negatív baktérium, amely vízben és talajban található meg, különösen a rizoszférában, viszonylag nagy népsűrűséggel (10). Ezt a mikroorganizmust széles körben tanulmányozták az aromás vegyületek, például a naftalin (11) és a sztirol (12, 13) biológiai lebontásának modelljeként. A hagyományos kármentesítési módszerek, mint például a talajkitermelés, amelyet koagulációs szűrés vagy ioncsere követ, drágák, zavaróak és nem széles körben használatosak (14). A Sphingomonas desiccabilis és az arsM-t expresszáló Bacillus idriensis képes eltávolítani az arzént a szennyezett talajból, de a plazmidból történő expresszió korlátozza azok hasznosságát (15). A Pseudomonas fajoknak lehetőségük van a szerves vegyületek rhizoremediációjára (16), de arzén eltávolítására nem használták őket.
a vizsgálat célja egy P törzs felépítése volt. putida KT2440 az arzén szennyezett talajból történő eltávolításának lehetőségével. A Chlamydomonas reinhardtii arsM gént használtuk, amely egy ArsM ortológust (CrArsM) kódol. In vitro, tisztított CrArsM metilezett,mint (III)a különböző fajok (lásd ábra. S1A a kiegészítő anyagban). 7 óra elteltével a metilarzenit és a dimetilarzenát viszonylag azonos mennyiségben termelődött. 14 óra elteltével a termék elsősorban DMAs(V) volt, kisebb mennyiségű trimetilarzin-oxiddal, MAs(III) nélkül. Ezek az eredmények összhangban vannak a mono-, di-és trimetiltermékek egymást követő metilezési lépéseivel. A TMA(III) gázt H2O2-vel impregnált szűrőkön TMA (V)O-vá történő oxidációval lehetett kimutatni (Lásd az ábrát. S1B a kiegészítő anyagban). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a tisztított CrArsM az As(III) metiláció három egymást követő fordulóját katalizálja, és a toxikus szervetlen arzént kevésbé mérgező vagy nem mérgező szerves arzénanyagokká alakítja.
a kanamicin promoter mögött álló C. reinhardtii arsM gént integrálták a P. putida kt2440 kromoszómájába, amely nem rendelkezik arsM génnel és nem metilálja az arzént. Minitransposon szállítási plazmid pBAM1 öngyilkossági vektorként használták stabil integránsok előállítására, amelyek alkotmányosan expresszálhatják az arsM-t. Az arsM gént pbam1-be klónozták (Lásd az ábrát. S2 a kiegészítő anyagban), majd ezt követően az Escherichia coli Cc118 Ppir-ből a P. putida KT2440-be vitték át háromoldalú konjugációval egy segítő törzzsel. A vad típusú P. putida két kromoszómális arsRBCH operonnal rendelkezik, és 2 mM As(III) jelenlétében növekedhet, ami versenyelőnyt biztosít a P. putida számára a szennyezett talajban (10). Ez döntő tényező lehet a sejtek növekedésének fenntartásában őshonos baktériumpopulációk jelenlétében (14). A CrArsM-et expresszáló P. putida KT2440 sejtjei 7,5-10 mM-re rezisztensek voltak(III) folyékony bazális só M9 közegben (ábra. 1). Az arzén sejtekben történő biotranszformációját 25 (III) vagy arzén (III. 2). 12 óra elteltével a módosított P. putida biometilezett(III) – ként, elsősorban DMA-kká (V) és kisebb mértékben metilarzenáttá (Fig. 2A). Időfüggő módon a mesterséges sejtek dimetilarzint és TMA(III) gázokat állítottak elő, amelyeket úgy azonosítottak, hogy azokat DMA-kká(V) és TMA-kká(V)O-vá OXIDÁLTÁK H2O2-vel (ábra. 2B). Ezenkívül a metilezési reakció termékét a CrArsM-et expresszáló P. putida sejtjeiben számszerűsítettük. 48 óra elteltével a táptalajban található fő termék a DMAs(V) volt (az összes arzén 57% – a), kisebb mennyiségű MAs(V) (31%) és még kevesebb TMA(V)O (8%) (ábra. 2C). A transzgenikus P. putida törzs gyorsan metilezett, mint (V) (ábra. 2A, 4. görbe). Két arsRCBH operon van a P kromoszómájában. putida, ezért ésszerű feltételezni, hogy a kromoszómálisan kódolt ArsC reduktáz gyorsan redukálódik as (V) – ről as(III) – ra, a crarsm szubsztrátjára, lehetővé téve a talajbaktérium metilációját mind as(V), mind As(III) – ra.