- Abstract
- 1. Introduzione
- 2. Materiali e metodi
- 2.1. Campioni di pazienti
- 2.2. Analisi del sangue e calcolo dell’attività della malattia
- 2.3. EBV Immortalization
- 2.4. L’analisi della citometria a flusso
- 2.5. LCLs Proliferation Assay
- 2.6. Analisi statistica
- 3. Risultati e discussione
- 3.1. Attività della malattia dei soggetti dello studio
- 3.2. La generazione di LCLS
- 3.3. Calcolo del tasso di crescita e del tempo di raddoppio degli LCLS generati
- 3.4. L’espressione del marcatore di superficie di LCLS
- 3.5. Correlazione dell’attività della malattia, livello di espressione del marcatore di superficie e proliferazione di LCL
- 4. Conclusioni
- Disponibilità dei dati
- Conflitti di interesse
- Ringraziamenti
- Materiali supplementari
Abstract
Epstein-Barr virus (EBV) è uno dei comuni tipi di herpesvirus umani nel mondo. EBV è noto per infettare più del 95% degli adulti nel mondo. Il virus infetta principalmente i linfociti B e potrebbe immortalare e trasformare le cellule in linee cellulari linfoblastoidi portatori di EBV (LCLS). Studi limitati sono stati focalizzati sulla caratterizzazione dell’espressione del marcatore superficiale degli LCLS immortalati. Questo studio dimostra la generazione di 15 LCLS da sedici pazienti con artrite reumatoide (RA) e da un volontario sano che utilizza EBV derivato da B95-8 marmoset. Il tasso di successo della generazione LCL è stato dell ‘ 88,23%. Tutti i CD19 + LCLS hanno espresso CD23 (16,94-58,9%) e CD27 (15,74-80,89%) sulla superficie cellulare. I nostri dati hanno dimostrato due distinte categorie di LCLS (a crescita rapida e lenta) (p<0,05) in base al loro tempo di raddoppio. Gli LCLS a crescita lenta hanno mostrato un livello di CD23 inferiore (35,28%) rispetto agli LCLS a crescita rapida (42,39%). Al contrario, gli LCLS a crescita lenta hanno mostrato una percentuale più alta sia in CD27 da solo che in CD23 + CD27 + in combinazione. Nel complesso, questi risultati possono suggerire le correlazioni dell’espressione cellulare CD23 e CD27 con il tasso di proliferazione degli LCLS generati. L’espressione di aumento di CD23 può giocare un ruolo nell’immortalizzazione di EBV delle cellule B e nella crescita e nel mantenimento degli LCLS EBV-trasformati mentre l’espressione di CD27 potrebbe avere effetti inibitori sulla proliferazione di LCL. Ulteriori indagini sono giustificate a queste speculazioni.
1. Introduzione
Epstein-Barr virus (EBV) ha infettato più di 95% adulti a livello globale . L’EBV colpisce e infetta principalmente le cellule B seguite dalle cellule epiteliali e, in misura minore, dalle cellule T CD4 . I virioni infettivi sono prodotti seguendo la replicazione litica nelle cellule B e nelle cellule epiteliali. Dopo il ciclo litico, la latenza EBV segue e persiste nelle cellule B infette per il resto della vita dell’individuo . EBV provoca principalmente mononucleosi infettiva ed è anche strettamente associata a neoplasie linfoidi ed epiteliali come il linfoma di Burkitt, il linfoma di Hodgkin, il carcinoma nasofaringeo e il cancro gastrico .
EBV infetta le cellule B e potrebbe immortalare le cellule B e formare LCLS crescenti a lungo termine che esprimono costantemente i virus . Questo metodo è stato utilizzato nei laboratori per immortalare alcune cellule B derivate dal sangue umano che possono essere successivamente utilizzate come modello di coltura per vari studi, tra cui lo screening della libreria di farmaci su larga scala, lo studio del vaccino e gli studi biologici ad alta produttività . Tra tutti, EBV prodotto da B95-8, una linea cellulare uistoset, sembra essere la fonte EBV più comune e potente per l’immortalizzazione delle cellule B. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno messo in sforzo per migliorare il metodo di immortalizzazione e la sua efficienza . Recentemente, è stato dimostrato che con una modifica minore, LCLs potrebbe essere generato da un piccolo volume di sangue periferico a partire da 0,1 mL . Questo risultato è particolarmente utile in una circostanza in cui il volume del campione è limitato.
Studi precedenti hanno riportato che le cellule immunitarie in particolare le cellule B e i loro sottoinsiemi svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi dell’AR . Nonostante il successo dell’immortalizzazione EBV delle cellule B, poco è stato fatto sulla caratterizzazione degli LCLS e sul suo confronto con le cellule B parentali. In questo studio, abbiamo dimostrato che l’EBV potrebbe immortalare in modo efficiente le cellule B dal sangue periferico dei pazienti con RA e formare LCLS. Abbiamo quindi esaminato i livelli di espressione di diversi marcatori di sottopopolazione delle cellule B, tra cui CD23 e CD27 in entrambi gli LCLS e le loro cellule B parentali. Queste sottopopolazioni di cellule B sono state precedentemente associate alla presentazione clinica di pazienti con AR. Ad esempio, nei pazienti con AR sono state rilevate elevate cellule B che esprimono CD23 e potrebbero essere bloccate da anticorpi monoclonali . Allo stesso modo, una maggiore quantità di cellule B di memoria IGD CD27+è stata prontamente rilevata anche in pazienti con AR attiva . D’altra parte, Hu e colleghi hanno dimostrato che le cellule B CD27+ sono correlate negativamente con l’attività della malattia di RA e sono risultate compromesse nei pazienti .
In questo studio, abbiamo cercato di valutare il livello di espressione di CD23 e/o CD27 di cellule B dalle PBMC e LCLS derivate da pazienti con AR. Abbiamo anche studiato il livello di espressione di CD23 e CD27 per quanto riguarda la crescita cellulare di LCLS.
2. Materiali e metodi
2.1. Campioni di pazienti
5 ml di sangue periferico di sedici pazienti con AR (Tabella 1) sono stati raccolti presso il Sunway Medical Center, Malesia, con un codice di approvazione etica di 011/2017/ER. Le PBMC sono state isolate utilizzando il metodo Ficoll-Paque (GE Healthcare). In breve, il sangue raccolto nella provetta EDTA è stato diluito 1 a 1 con soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e stratificato sulla soluzione Ficoll-Paque in una provetta da centrifuga fresca. Il tubo è stato centrifugato a 400 xg per 40 minuti a temperatura ambiente con bassa accelerazione e ‘freno off ‘. Lo strato superiore che è il plasma è stato raccolto e aliquota prima di conservare a -80°C. Il buffy coat contenente PBMCS è stato raccolto utilizzando una pipetta Pasteur da 3 ml e trasferito in una provetta da centrifuga fresca. Le cellule sono state lavate due volte con PBS seguito da mezzo RPMI contenente 10% siero bovino fetale (FBS), prima crioconservato in 10% DMSO e conservato in serbatoio di azoto liquido. 5mL di sangue è stato donato da un volontario sano come controllo. I PBMC e il plasma sono stati elaborati e conservati come descritto sopra. La data della diagnosi, il prelievo di sangue, la crioconservazione dei PBMC e l’immortalizzazione dell’EBV sono mostrati in materiali supplementari (disponibili qui).
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Anti-CCP: anti-peptide citrullinato ciclico anticorpo; CRP: proteina C-reattiva; DAS28: punteggio di attività di malattia 28; ESR: velocità di sedimentazione eritrocitaria; RF: fattore reumatoide.
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2.2. Analisi del sangue e calcolo dell’attività della malattia
2.3. EBV Immortalization
B95-8 surnatante EBV derivato da marmoset è stato un gentile regalo del Dr. Alan Soo-Beng Khoo, unità di patologia molecolare, Istituto per la ricerca medica (IMR), Malesia. Le cellule B del sangue periferico del paziente sono state immortalate utilizzando il surnatante EBV concentrato come descritto in precedenza . La tabella in materiali supplementari mostra la data di isolamento PBMC e crioconservazione, istituzione LCLS, e la durata di PBMC crioconservati immagazzinati in serbatoio di azoto liquido. In breve, un flaconcino di PBMC precedentemente crioconservato è stato scongelato e il numero di cellule è stato determinato. Le celle sono state regolate a 2 x 106 / mL utilizzando surnatante EBV appena scongelato e incubate durante la notte a 37°C, 5% di CO2 in un pallone T25 in piedi. Il giorno successivo, il mezzo di trasformazione (RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml ciclosporina) è stato aggiunto nel pallone. Le cellule infette da EBV sono state osservate al microscopio per cercare LCLS trasformati simili a rosette in cluster. LCLs nei passaggi 3-6 sono stati utilizzati per l’analisi della citometria a flusso e il test di proliferazione cellulare.
2.4. L’analisi della citometria a flusso
La citometria a tre colori è stata eseguita sul citometro a flusso FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizzando anticorpi monoclonali che identificano antigeni di superficie per cellule T (CD3/PE, clone SK7), cellule B (CD19/BB515, HIB19) e sottoinsiemi di cellule B (CD23/APC, clone EBV-CS5 e CD27/PE, clone L128). La soluzione di vitalità cellulare 7AAD (VIA-SONDA) è stata acquistata per determinare la vitalità cellulare. Tutti gli anticorpi sono stati acquistati da Becton Dickinson. In breve, i PBMC crioconservati sono stati scongelati e risospesi in 50 Μl di tampone antimacchia BSA (Becton Dickinson) e incubati a temperatura ambiente al buio con anticorpi coniugati al fluorocromo prediluiti per 30 minuti. I PBMC sono stati quindi lavati due volte con BSA stain buffer e risospesi in 500µL di BSA buffer per l’analisi della citometria a flusso. Le sospensioni Control PBMC sono state preparate con la stessa procedura. 20.000 cellule vitali determinate dal colorante di vitalità cellulare sono state gated e raccolte per analisi a tre colori in gruppi di CD3 / CD19 / CD23 e CD19/CD27 / CD23. I dati sono stati analizzati utilizzando il software CellQuest Pro (Becton Dickinson).
2.5. LCLs Proliferation Assay
Per separare gli LCLS in due categorie (a crescita rapida e lenta), il tasso di proliferazione cellulare è stato determinato utilizzando RealTime – Glo MT cell viability assay (Promega) seguendo le istruzioni del produttore. Ciò è un’analisi basata a luminescenza nonlytic che può individuare la proliferazione in tempo reale delle cellule vive in coltura fino a 72 ore. In breve, 10.000 cellule / pozzo sono state seminate su una piastra bianca a fondo piatto da 96 pozzetti (Greiner Bio-one) in triplice copia. La miscela di reazione 2X è stata preparata dal kit fornito e aggiunta a ciascun pozzetto. Le cellule sono state incubate a 37°C, 5% di CO2 per 1 ora prima che la misurazione fosse effettuata in diversi punti temporali(0, 16, 20, 24, 40, 44, 48, 64, 68, e 72 ore) utilizzando un lettore di micropiastre a luminescenza (Tecan). Il grafico relativo delle unità di luminescenza (RLUS) rispetto al tempo è stato tracciato per mostrare la curva di crescita degli LCLS. In questo grafico, il numero di cella era rappresentato dal RLUS. Utilizzando il RLUS, il tempo di raddoppio (tempo necessario per un numero di cella di raddoppiare in valore) di ogni categoria di LCLS è stato calcolato utilizzando un calcolatore online multipunto che sono stati utilizzati per i test di significatività . Questo strumento online utilizza il metodo esponenziale dei minimi quadrati per calcolare il tempo di raddoppio . Il tasso di crescita (numero di raddoppiamenti che si verificano per unità di tempo) è stato quindi calcolato utilizzando la seguente formula:Il valore medio del tempo di raddoppio di tutti gli LCLS è stato di 54,69 ore. Quindi, questo valore è stato utilizzato come cutoff e LCLS con tempo di raddoppio superiore a 54.69 ore sono state raggruppate in LCLS a crescita lenta e viceversa per LCLS a crescita rapida.
2.6. Analisi statistica
L’analisi della citometria a flusso è stata eseguita in tre esperimenti indipendenti per ciascuna categoria di LCLS, se non diversamente specificato. I dati sono stati espressi in valori medi deviazioni standard (std. dev). La significatività è stata determinata utilizzando test non parametrici (Mann-Whitney e Kruskal-Wallis H) in cui i dati sono considerati significativi quando p è inferiore a 0,05.
3. Risultati e discussione
3.1. Attività della malattia dei soggetti dello studio
La Tabella 1 mostra i dati demografici dei sedici pazienti con AR e di un individuo sano e i risultati degli esami del sangue dei marcatori diagnostici RA comunemente usati che indicano le loro attività di malattia. Sulla base dell’indice DAS28-CRP di 16 pazienti con AR, 3 di questi pazienti sono stati classificati come alta attività della malattia, 8 come attività moderata, 3 come remissione e i restanti due come stato sconosciuto a causa della raccolta incompleta dei dati.
3.2. La generazione di LCLS
PBMC è stata prelevata dai sedici pazienti con AR e da un donatore sano (etichettato come C) (Tabella 1) e crioconservato. Aliquote di PBMC crioconservate sono state quindi utilizzate per l’infezione da EBV. Dei diciassette flaconi, 15 LCLS trasformati da EBV (tranne 4E e 14A) sono stati generati una settimana dopo l’infezione in cui sono stati visti cluster di cellule visibili dai flaconi. Quando visualizzate al microscopio, le LCLS hanno mostrato la tipica morfologia delle rosette con varie dimensioni come indicato dalle frecce rosse (Figura 1). Il tasso di successo della generazione di LCLS è stato dell ‘ 88,23% (15 su 17).
3.3. Calcolo del tasso di crescita e del tempo di raddoppio degli LCLS generati
Abbiamo quindi determinato il tasso di crescita di ciascuna categoria di LCLS generata utilizzando un test di proliferazione cellulare basato sulla luminescenza non lineare e in tempo reale. La figura 2 mostra la curva di crescita di ciascuna categoria di LCLS rappresentata dalle relative unità di luminescenza (RLUS). La tabella 2 mostra il tempo di raddoppio calcolato e il tasso di crescita dei rispettivi LCLS utilizzando un calcolatore online . Dal tempo di raddoppio ottenuto di ciascuna categoria di LCLS, dividiamo gli LCLS in due categorie usando 54.69 ore (valore medio di tutti gli LCLS) come valore di cut-off, che ha portato a 10 LCLS a crescita rapida e 5 a crescita lenta (Tabelle 2 e 4) (p<0,05).
3.4. L’espressione del marcatore di superficie di LCLS
PBMC e LCLS corrispondenti sono stati sottoposti ad analisi di citometria a flusso per determinare la loro espressione del marcatore di superficie inclusi CD3, CD19, CD23 e CD27. CD3 e CD19 sono marcatori di superficie per le cellule T e le cellule B, rispettivamente. Usando i PBMC isolati dal paziente 8A e il corrispondente LCL-8A come esempi, la Figura 3 mostra come le cellule T CD3+ e le cellule B CD19+ sono state profilate e chiuse mediante citometria a flusso. Il livello di espressione è stato quindi presentato in percentuale rispetto al numero totale di linfociti analizzati che erano 20.000 cellule. Nelle PBMC dei donatori, il 29,78-81,8% erano cellule T, mentre il 2,35-45,95% erano cellule B. Dopo la trasformazione EBV, le popolazioni di cellule T si sono ridotte allo 0-0, 27% mentre le popolazioni di cellule B sono aumentate al 68,59-89,35%. Ciò indica chiaramente il successo dell’immortalizzazione delle cellule B da parte di EBV che ha assunto la popolazione delle cellule T. CD3 + cellule T senesced e sarebbe completamente lavato via dal LCLs.
CD23 è un marcatore di attivazione delle cellule B mentre CD27 è un marcatore per le cellule B di memoria . Nei pazienti affetti da AR, livelli elevati di cellule B che esprimono CD23 sono stati precedentemente riportati in correlazione positiva con l’attività della malattia e potrebbero potenzialmente servire come bersaglio terapeutico . Al contrario, le cellule B CD27+ sono state trovate in correlazione negativa con l’attività della malattia e sono risultate compromesse nei pazienti con AR . Nello studio attuale, non siamo riusciti a differenziare il modello di espressione di CD23 e CD27 in PBMC e LCLS (Tabella 3). La figura 4 descrive il gating di CD19+, CD23 + e CD27 + dalle PBMC isolate dal paziente 8A e dal corrispondente LCL-8A mediante citometria a flusso. Da tutti gli LCLS, mentre 68.59-89.35% erano CD19 + come previsto, mostrano espressione di CD23 (16.94-58.9%) e CD27 (15.74-80.89%). Le cellule B che coesprimevano CD23 e CD27 erano 5,72-41,53% (Tabella 3).
3.5. Correlazione dell’attività della malattia, livello di espressione del marcatore di superficie e proliferazione di LCL
È stata eseguita un’analisi statistica per testare la correlazione tra l’attività della malattia e le espressioni del marcatore di superficie; tuttavia, nessuna di esse ha mostrato significato. Allo stesso modo, l’attività della malattia non è correlata con il tasso di crescita dei LCLS corrispondenti.
Dal tempo di raddoppio di ciascuna categoria di LCLS, i valori medi per LCLS a crescita rapida e lenta sono stati determinati e sottoposti ad analisi statistiche. La tabella 4 mostra una differenza significativa (p<0.05) in termini di tempo di raddoppio tra le due categorie. Allo stesso modo, sono stati determinati i valori medi dei livelli CD23, CD27 e CD23+CD27+ della rispettiva categoria. Le LCLS a crescita rapida hanno una maggiore espressione di CD23 (42,39%) rispetto alle LCLS a crescita lenta (35,28%). Tuttavia, questo non è statisticamente significativo (Tabella 4). Inversamente, l’espressione di CD27 e la coespressione di CD23/CD27 erano inferiori nei LCLS a crescita rapida (36,15 e 13,36%, rispettivamente) rispetto ai LCLS a crescita lenta (51,57% e 19,49%, rispettivamente). Quando viene eseguita un’analisi statistica, solo gli LCLS in rapida crescita mostrano significativamente più bassi nell’espressione CD27 ma non CD23/CD27. Ulteriori studi con campioni di dimensioni maggiori sono necessari per convalidare questi risultati.
L’alta espressione di CD23 potrebbe essere dovuta all’infezione o alla trasformazione dell’EBV. Ci sono prove che dimostrano che l’immortalizzazione delle cellule B potrebbe fare affidamento sull’espressione CD23 cellulare. Lo studio ha dimostrato che le cellule B CD23-negative potrebbero essere infettate da EBV ma non potrebbero essere immortalate a meno che non si integrino con specifici fattori di crescita . Un altro studio ha dimostrato che le cellule B infette da EBV potrebbero svilupparsi in due sottopopolazioni distinte: CD58+IL6 – e CD58+IL6+ . La prima sottopopolazione delle cellule B proliferava attivamente mentre la seconda sottopopolazione cessava di proliferare. L’espressione di CD23 potrebbe anche essere indotta dall’espressione dell’antigene nucleare EBV 2 (EBNA-2) in seguito alla trasformazione EBV delle cellule B come precedentemente descritto in una linea cellulare del linfoma di Burkitt (BL). Al contrario, la maggiore espressione di CD27 negli LCLS a crescita lenta può suggerire i loro effetti inibitori sulla proliferazione degli LCLS.
4. Conclusioni
CD23 potrebbe svolgere un ruolo stimolante nella trasformazione EBV delle cellule B e nella crescita degli LCLS. I nostri studi hanno dimostrato che gli LCLS in rapida crescita mostravano un’espressione CD23 più alta e un’espressione CD27 più bassa e l’espressione CD23CD27. Ulteriori studi con una dimensione del campione più ampia sono giustificati per indagare in profondità sull’implicazione dell’espressione del marcatore di superficie sul mantenimento dell’EBV e sulla crescita cellulare.
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non vi sono conflitti di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Alan Soo-Beng Khoo dell’Unità di patologia molecolare, Istituto per la ricerca medica (IMR), Malesia, per la sua generosità nel fornirci l’EBV derivato da marmoset B95-8 per il nostro lavoro di immortalizzazione. Hooi-Yeen Yap è il destinatario del Master della Sunway University con borsa di studio di ricerca. Questa ricerca è stata finanziata da Sunway University Internal Research Grant 2019 (INT-2019-SHMS-DMS-01), National Cancer Council Malaysia (MAKNA) Cancer Research Award (CRA) 2016 (EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01) e Sunway Medical Centre Research Funds (SRC/002/2017/FR e SRC/003/2017/FR).
Materiali supplementari
La tabella mostra i casi studiati con data di diagnosi, prelievo di sangue, crioconservazione delle PBMC, immortalizzazione EBV e durata delle PBMC crioconservate. (Materiali supplementari)