La carbamoil fosfato sintetasa (CPSasa) es una enzima heterodimérica compuesta de una subunidad pequeña y una gran (con la excepción de la CPSasa III, que está compuesta de un único polipéptido que puede haber surgido de la fusión génica de los dominios glutaminasa y sintetasa). La CPSase tiene tres sitios activos, uno en la subunidad pequeña y dos en la subunidad grande. La subunidad pequeña contiene el sitio de unión a la glutamina y cataliza la hidrólisis de la glutamina a glutamato y amoníaco, que a su vez es utilizado por la cadena grande para sintetizar fosfato de carbamoilo. La subunidad pequeña tiene una estructura beta / beta / alfa de 3 capas, y se cree que es móvil en la mayoría de las proteínas que la transportan. El dominio C-terminal de la pequeña subunidad de la CPSasa tiene actividad de glutamina amidotransferasa. La subunidad grande tiene dos dominios homólogos de carboxi fosfato, los cuales tienen sitios de unión a ATP; sin embargo, el dominio carboxi fosfato N-terminal cataliza la fosforilación del biocarbonato, mientras que el dominio C-terminal cataliza la fosforilación del intermedio carbamato. El dominio carboxi fosfato que se encuentra duplicado en la subunidad grande de la CPSasa también está presente como una sola copia en las enzimas dependientes de biotina acetil-COA carboxilasa (ACC), propionil-coa carboxilasa (PCCase), piruvato carboxilasa (PC) y urea carboxilasa.
La subunidad grande en la CPSasa bacteriana tiene cuatro dominios estructurales: el dominio carboxi fosfato 1, el dominio de oligomerización, el dominio carbamoil fosfato 2 y el dominio alostérico. Los heterodímeros de CPSasa de Escherichia coli contienen dos túneles moleculares: un túnel de amoníaco y un túnel de carbamato. Estos túneles entre dominios conectan los tres sitios activos distintos, y funcionan como conductos para el transporte de productos intermedios de reacción inestables (amoníaco y carbamato) entre sitios activos sucesivos. El mecanismo catalítico de la CPSasa implica la difusión de carbamato a través del interior de la enzima desde el sitio de síntesis dentro del dominio N-terminal de la subunidad grande hasta el sitio de fosforilación dentro del dominio C-terminal.