Hydrophobic interactiechromatografie (hic) is één van de wijdst gebruikte methodes voor het scheiden en zuiveren van proteã nen in hun inheemse staat. HIC blijkt ook heel nuttig te zijn bij het isoleren van eiwitcomplexen en bij het bestuderen van eiwitvouwen en-ontvouwen. Hoe werkt HIC? Wat zijn de principes achter deze techniek? Om het mechanisme achter dit type van chromatografie te begrijpen, zijn hier sommige dingen die u zeker moet weten.
Hoe werkt HIC?
In een notendop scheidt HIC (ook bekend als ‘uitzouten’) eiwitmoleculen met behulp van de eigenschappen van hydrofobiciteit. In deze methode, worden de proteã nen die zowel hydrofiele als hydrophobic gebieden bevatten toegepast op een HIC kolom onder hoge zoute buffervoorwaarden.
het zout in de buffer (meestal ammoniumsulfaat) vermindert de solvatie van monsteroplossingen en blootstelt de hydrofobe gebieden langs het oppervlak van het eiwitmolecuul. Dit vergemakkelijkt de adsorptie van deze hydrophobic gebieden aan de hydrophobic gebieden op de stevige steun en precipiteert (kristalliseert) proteã nen uit de oplossing.
houd er rekening mee dat bij het uitvoeren van dit type chromatografie de toevoeging van lyotrofe zouten het hydrofobe effect versterkt en het aantal en het volume van individuele hydrofobe holtes vermindert, terwijl het verlagen van de zoutconcentratie zal leiden tot desorptie uit de vaste drager. Als zodanig, kan de steekproefelutie door het verminderen van zoutgradiënt worden vergemakkelijkt. Milde organische modificatoren of detergenten kunnen ook worden toegevoegd aan de elutiebuffer om te helpen bij het elutieproces.
met behulp van de principes van HIC kunt u eiwitten uit waterige oplossingen in verschillende mate binden, afhankelijk van de structuur van uw eiwit, de zoutconcentratie, de pH, de temperatuur en de gebruikte organische oplosmiddelen.
Hydrofobe Interactiechromatografie: Het blootleggen van de onderliggende theorieën
er zijn drie belangrijke theorieën die kunnen helpen het mechanisme achter HIC te verklaren – (1) de salting out theorie, (2) de thermodynamische theorie en (3) de oppervlaktespanning of Van der Waals krachten theorie.
Salting Out Theory
volgens de salting out theory vormen de hydrofobe aminozuren beschermde hydrofobe gebieden bij het vouwen in waterige oplossing, terwijl de hydrofiele aminozuren eiwitten in staat stellen zich te binden met de waterstofmoleculen in het water. Als gevolg hiervan zal de kans dat het eiwit zal oplossen in water toenemen als er voldoende hydrofiele gebieden aanwezig zijn in het oppervlak van de eiwitmoleculen.
echter, na toevoeging van anti-chaotrofische zouten (zoals ammoniumsulfaat en natriumsulfaat) in de oplossing, zullen sommige watermoleculen interageren met de zoutionen in plaats van het geladen deel van het eiwit. Wanneer de eiwit-eiwitinteractie in de oplossing sterker wordt dan de oplosmiddel-opgeloste interactie, reageren de eiwitmolecules vrij met elkaar-toestaand hen om samen te voegen en uiteindelijk uit de oplossing neer te slaan. Vandaar, vermindert de toevoeging van zout in de oplossing de oplosbaarheid van verschillende proteã nen in variërende mate.
thermodynamica theorie
deze theorie stelt dat de interactie tussen hydrofobe moleculen een entropie-gedreven proces is, gebaseerd op de tweede wet van de thermodynamica. De hydrophobic interactie tussen twee of meer apolaire molecules in een polaire oplossingsoplossing is een spontaan proces dat door een verandering in entropie wordt geregeld. Dergelijke interacties kunnen echter worden gewijzigd door de temperatuur te regelen of door de oplosmiddelpolariteit te wijzigen.
als zodanig, wanneer een apolair molecuul in contact komt met een polair oplosmiddel zoals water, zal er een toename zijn in de Orde van de oplosmiddelmoleculen rond het hydrofobe molecuul. Zolang de enthalpie niet significant toeneemt, zal dit een afname van de entropie veroorzaken en een algehele positieve verandering in de Gibbs-energie opleveren. Als zodanig zal de ontbinding van een apolair molecuul in een polair oplosmiddel niet spontaan plaatsvinden omdat het niet thermodynamisch gunstig is.
echter, wanneer je twee of meer apolaire moleculen in een polaire omgeving plaatst, zullen de hydrofobe oppervlakken van de macromoleculen verborgen zijn van de polaire omgeving en zullen de hydrofobe moleculen spontaan aggregeren. De sterk gestructureerde oplosmiddelmoleculen die het blootgestelde oppervlak van de hydrofobe moleculen omringen zullen naar het grootste deel van het oplosmiddel worden verplaatst dat uit minder gestructureerde moleculen bestaat. Als gevolg daarvan neemt de entropie toe terwijl de Gibbs energie afneemt. Onder dergelijke gevallen wordt hydrofobe interactie een thermodynamisch gunstig proces.
oppervlaktespanning, van der Waals theorie
deze theorie suggereert dat de hydrofobe interactie in HIC afhankelijk is van Van der Waals krachten tussen eiwitten en geïmmobiliseerde liganden omdat deze krachten toenemen naarmate de geordende structuur van water toeneemt in aanwezigheid van zouten.