tekst
arszenik jest ludzkim czynnikiem rakotwórczym klasy I, który stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi. Ekspozycja na arsen jest związana z rakiem skóry, rakiem pęcherza moczowego, cukrzycą, chorobami układu krążenia i chorobami naczyń obwodowych (1, 2). Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA) zajmuje pierwsze miejsce na liście substancji niebezpiecznych Superfund (http://www.atsdr.cdc.gov/SPL/index.html).
arsen jest uwalniany do środowiska poprzez aktywność geotermalną, rozpuszczanie minerałów i działalność antropogeniczną, taką jak ścieki przemysłowe, spalanie paliw kopalnych oraz stosowanie pestycydów zawierających arsen, herbicydów, środków do konserwacji drewna i dodatków paszowych (3). W wyniku stosowania zanieczyszczonej arsenem wody do nawadniania, arsen gromadzi się w ryżu, podstawowym pożywieniu dla połowy populacji świata (4). Metylacja arsenu jest szlakiem detoksykacji (5, 6). Wiele organizmów ma geny kodujące metylotransferazy Arsenitu S-adenozylometioniny (SAM) (określane jako ArsM w drobnoustrojach i AS3MT w organizmach wyższych), które biotransformują jako (III) do metylowanych gatunków, z lotną nietoksyczną trimetyloarsyną (7) jako produktem końcowym(5, 6, 8, 9). Pseudomonas putida to Gram-ujemna bakteria występująca w wodzie i glebie, szczególnie w rhizosferze o stosunkowo dużej gęstości zaludnienia (10). Mikroorganizm ten był szeroko badany jako model biodegradacji związków aromatycznych, takich jak naftalen (11) i styren (12, 13). Konwencjonalne metody rekultywacji, takie jak wykopywanie gleby, a następnie filtracja koagulacyjna lub wymiana jonowa, są drogie, uciążliwe i nie są powszechnie stosowane (14). Sphingomonas desiccabilis i Bacillus idriensis wyrażające arsM mogą usuwać arsen z zanieczyszczonej gleby, ale ekspresja z plazmidu ogranicza ich użyteczność (15). Gatunki Pseudomonas mają perspektywę rhizoremediacji związków organicznych (16), ale nie były wykorzystywane do usuwania arsenu.
celem tego badania było skonstruowanie szczepu P. putida KT2440 z możliwością usuwania arsenu z zanieczyszczonej gleby. Użyliśmy genu Chlamydomonas reinhardtii arsM kodującego ortolog ArsM (CrArsM). In vitro oczyszczony Krarsm metylowany jako (III) do różnych gatunków (patrz Fig. S1A w materiale uzupełniającym). Po 7 godzinach otrzymano metyloarsenit i dimetyloarsenat w stosunkowo równych ilościach. Po 14 h produktem był głównie DMAs (V), z mniejszą ilością tlenku trimetyloarsyny i bez MAs(III). Wyniki te są zgodne z sekwencyjnymi etapami metylacji produktów mono -, di-i trimetylowych. Gaz TMAs (III)można wykryć na filtrach impregnowanych H2O2 przez utlenianie do TMAs(V) O (patrz Rys. S1B w materiale uzupełniającym). Wyniki te pokazują, że oczyszczony Krarsm katalizuje trzy sekwencyjne rundy metylacji As(III) i przekształca toksyczny arsen nieorganiczny w mniej toksyczne lub nietoksyczne organiczne arsenicals.
Gen C. reinhardtii arsm stojący za promotorem kanamycyny został zintegrowany z chromosomem P. putida KT2440, który nie posiada genu arsM i nie metyluje arsenu. Plazmid dostarczający minitransposon pbam1 był używany jako wektor samobójczy do generowania stabilnych liczb całkowitych, które mogłyby konstytucyjnie wyrażać arsm. Gen arsM został sklonowany do pBAM1 (patrz ryc. S2 w materiale uzupełniającym), a następnie przeniesiony z Escherichia coli CC118λpir do P. putida KT2440 przez trójstronną koniugację ze szczepem pomocniczym. Dziki Typ P. putida ma dwa chromosomalne operony arsRBCH i może rosnąć w obecności 2 mM jako (III), co zapewnia przewagę konkurencyjną dla P. putida w zanieczyszczonej glebie (10). Może to być kluczowy czynnik dla utrzymania wzrostu komórek w obecności rdzennych populacji bakterii (14). Komórki P. putida KT2440 wykazujące ekspresję Krarsm były odporne na działanie 7,5 do 10 mM jako (III) w ciekłym podłożu z soli podstawowej M9 (Fig. 1). Biotransformację arsenu przez komórki oznaczono za pomocą 25 µM w postaci(III) lub arsenanu (Fig. 2). Po 12 godzinach zmodyfikowano P. putida jako biometylowany (III) głównie do DMAs (V)i, w mniejszym stopniu, metyloarsenatu (Fig. 2A). W zależności od czasu wytworzone komórki wytwarzały gazy dimetyloarsyny i TMAS (III), zidentyfikowane przez utlenianie ich do DMAs(V)i TMAs(V) O z H2O2 (Fig. 2b). Ponadto produkt reakcji metylacji oznaczono ilościowo w komórkach P. putida wyrażających Krarsm. Po 48 godzinach głównym produktem znalezionym w pożywce hodowlanej był DMAs(V) (57% całkowitego arsenu), przy mniejszej ilości MAs(V) (31%) i jeszcze mniejszej ilości TMAS(V)O (8%) (Fig. 2C). Transgeniczny szczep P. putida szybko metylował jako (V) (Fig. 2A, krzywa 4). W chromosomie P występują dwa operony arsRCBH. putida, więc rozsądne jest założenie, że chromosomalnie kodowana reduktaza ArsC szybko zmniejsza się jako (V) Do As (III), substratu CrArsM, umożliwiając bakteriom glebowym metylowanie zarówno jako(V), jak i As(III).