výsledky v kolorimetrické (absorbance) a fluorescence se změní. Resazurin je modrý a ne fluorescenční, zatímco resorufin je červený a vysoce fluorescenční. Je to citlivý test, pokud se pracuje s vyšší než 5×103 buněk / 100 µL, relativně non-toxické a za předpokladu, že je provedena pečlivě, stejná opakování lze sledovat přes několik časových bodů. Nevýhodou tohoto testu je, že to není přímé buněčné počítání technika jako heamocytometry, protože fluorescence nebo absorbance, signál může být ovlivněn tím, jak změny v počtu buněk a buněčného metabolismu.
Materiály & Metody
- 96 no černé polystyrenové mikrotitrační destičky (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH reader na mikrotitrační destičce
Brzy průchod Lidské Osteoblastické buňky (varná Deska 406-05a), dodávané podle Evropské Kolekce Buněčných Kultur ECACC byly nasazeny na substráty a a B při hustotě 104 na vzorek. Vzorky byly umístěny do jamky 24 jamkové desky, pokryty 1 ml kultivačního média a inkubovány celkem 17 dní. Kultivačním médiem bylo Mccoyovo 5A médium obsahující 10% tepelně inaktivovaného séra, 1% glutaminu a vitaminu C (30 µg / mL).
K měření buněčné proliferace, nasazený substráty byly inkubovány po dobu 4 hodin (delší inkubační doba může být použita pro větší citlivost) s čerstvým kultivačním médiu doplněném 10 obj.% alamarBlue®. Pro každý substrát bylo použito celkem 10 replik.
po inkubaci bylo 100 µL média z každé jamky přeneseno do 96jamkové černé polystyrenové mikrodestičky a replikováno 3krát. Fluorescence (excitace 530 nm, emise 590 nm) byla měřena na čtečce MIKROPLÁTKŮ BMG LABTECH. (Poznámka: kolorimetrická detekce může být monitorována měřením absorbance při 570 nm při použití 600 nm jako referenční vlnové délky. Má však tendenci být méně citlivý, protože při měření absorpcí dochází ke značnému překrývání oxidovaných a redukovaných forem alamarBlue®).
redukce alamarBlue® buňkami vyjádřená jako jednotky intenzity fluorescence byla měřena ve dnech 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 a 17 období kultury pro různé vzorky. % Snížení alamarBlue® pro každý případ bylo vypočteno pomocí vzorce