Dies führt zu kolorimetrischen (Absorptions-) und Fluoreszenzänderungen. Resazurin ist blau und nicht fluoreszierend, während Resorufin rot und stark fluoreszierend ist. Es ist ein empfindlicher Test, wenn mit mehr als 5×103 Zellen pro 100 µL gearbeitet wird, relativ ungiftig und vorausgesetzt, dass es sorgfältig durchgeführt wird, können die gleichen Replikationen über mehrere Zeitpunkte verfolgt werden. Der Nachteil dieses Assays besteht darin, dass es sich nicht um eine direkte Zellzählungstechnik wie die Heamozytometrie handelt, da das Fluoreszenz- oder Absorptionssignal sowohl durch Änderungen der Zellzahl als auch des Zellstoffwechsels beeinflusst werden kann.
Materialien & Methoden
- 96 well black polystyrol microplattes (Greiner Bio-One)
- AlamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH microplate reader
Human Osteoblast cells der frühen Passage (HOb 406-05a), geliefert von der European Collection of Cell Cultures ECACC, wurden auf die Substrate A und B mit einer Dichte von 104 pro Probe ausgesät. Die Proben wurden jeweils in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte gegeben, mit 1 ml Kulturmedium bedeckt und insgesamt 17 Tage inkubiert. Das Kulturmedium war McCoys 5A-Medium, das 10% hitzeinaktiviertes Serum, 1% Glutamin und Vitamin C (30 µg / ml) enthielt.
Zur Messung der Zellproliferation wurden die ausgesäten Substrate für 4 Stunden (längere Inkubationszeiten können für eine höhere Empfindlichkeit verwendet werden) mit frischem Kulturmedium, das mit 10 vol% AlamarBlue® ergänzt wurde, inkubiert. Für jedes Substrat wurden insgesamt 10 Replikate verwendet.
Nach der Inkubation wurden 100 µL Medium aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Mikroplatte aus schwarzem Polystyrol übertragen und 3 mal repliziert. Fluoreszenz (Anregung 530 nm, Emission 590 nm) wurde an einem BMG LABTECH Mikroplattenreader gemessen. (Hinweis: Die kolorimetrische Detektion kann durch Absorptionsmessungen bei 570 nm überwacht werden, während 600 nm als Referenzwellenlänge verwendet werden. Es neigt jedoch dazu, weniger empfindlich zu sein, da es eine erhebliche Überlappung der oxidierten und reduzierten Formen des AlamarBlue® gibt, wenn es durch Absorption gemessen wird).
Die AlamarBlue®-Reduktion durch die Zellen, ausgedrückt als Fluoreszenzemissionsintensitätseinheiten, wurde an Tagen 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 und 17 der Kulturperiode für verschiedene Proben. Die prozentuale Reduktion von AlamarBlue® für jeden Fall wurde mit der Formel
berechnet