isto resulta em alterações colorimétricas (absorvância) e fluorescentes. A resazurina é azul e não fluorescente, enquanto a resorufina é vermelha e altamente fluorescente. Trata-se de um ensaio sensível se se trabalhar com células superiores a 5×103 por 100 µL, relativamente não tóxicas e desde que seja efectuado cuidadosamente, podem seguir-se as mesmas replicações ao longo de vários pontos temporais. A desvantagem deste ensaio é que não é uma técnica de contagem celular direta como a heamocitometria, porque o sinal de fluorescência ou absorvância pode ser afetado por ambas as alterações no número de células e metabolismo celular.
Materiais & Métodos
- 96 bem preto microplacas de poliestireno (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys reino UNIDO)
- BMG LABTECH leitor de microplacas
Início da passagem Humana Osteoblastos, células (Fogão 406-05a), fornecido pelo serviço Europeu de Coleção de Culturas de Células ECACC foram semeadas em substratos A e B em uma densidade de 104 por exemplo. Cada uma das amostras foi colocada num poço de uma placa de 24 poços, coberta com 1 ml de meio de cultura e incubada durante um total de 17 dias. O meio de cultura era o 5-a do McCoy, contendo 10% de soro inactivado pelo calor, 1% de glutamina e vitamina C (30 µg/mL).
para medir a proliferação celular, os substratos semeados foram incubados durante 4 horas (podem ser utilizados períodos de incubação mais longos para uma maior sensibilidade) com meio de cultura fresco complementado com 10% vol de alamarBlue®. Um total de 10 replicados foram usados para cada substrato.
após incubação, 100 µL de cada alvéolo foi transferido para uma microplata de poliestireno preto de 96 alvéolos e replicado 3 vezes. A fluorescência (excitação 530 nm, emissão 590 nm) foi medida num leitor de microplacas da BMG LABTECH. (Nota: a detecção colorimétrica pode ser monitorizada por medições de absorvância a 570 nm, utilizando 600 nm como comprimento de onda de referência. No entanto, tende a ser menos sensível porque há uma sobreposição considerável das formas oxidadas e reduzidas do alamarBlue® quando medido por absorvância).
a redução de alamarBlue® pelas células, expressa em unidades de intensidade de emissão de fluorescência, foi medida em dias 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 e 17 do período de cultura para diferentes amostras. A redução percentual de alamarBlue® para cada caso foi calculada utilizando a fórmula