Esto da como resultado cambios colorimétricos (absorbancia) y de fluorescencia. La resazurina es azul y no fluorescente, mientras que la resorufina es roja y altamente fluorescente. Se trata de un ensayo sensible si se trabaja con células superiores a 5×103 por 100 µL, relativamente no tóxicas y, siempre que se lleve a cabo con cuidado, se pueden seguir las mismas réplicas a lo largo de varios puntos de tiempo. La desventaja de este ensayo es que no es una técnica de recuento celular directo como la heamocitometría, porque la señal de fluorescencia o absorbancia puede verse afectada tanto por los cambios en el número de células como por el metabolismo celular.
Materiales & Métodos
- 96 microplacas de poliestireno negro de pozo (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- Lector de microplacas BMG LABTECH
Las células osteoblásticas humanas de paso temprano (HOb 406-05a), suministradas por la Colección Europea de Cultivos Celulares ECACC, se sembraron en sustratos A y B a una densidad de 104 por muestra. Las muestras se colocaron en un pozo de una placa de 24 pocillos, se cubrieron con 1 ml de medio de cultivo y se incubaron durante un total de 17 días. El medio de cultivo fue el medio 5A de McCoy que contenía un 10% de suero inactivado por calor, un 1% de glutamina y vitamina C (30 µg/mL).
Para medir la proliferación celular, los sustratos sembrados se incubaron durante 4 horas (se pueden usar tiempos de incubación más largos para una mayor sensibilidad) con medio de cultivo fresco complementado con alamarBlue®de 10 vol.%. Se utilizaron un total de 10 réplicas para cada sustrato.
Después de la incubación, se transfirió medio de 100 µL de cada pozo a una microplaca de poliestireno negro de 96 pozos y se replicó 3 veces. La fluorescencia (excitación 530 nm, emisión 590 nm) se midió en un lector de microplacas BMG LABTECH. (Nota: La detección colorimétrica puede monitorizarse mediante mediciones de absorbancia a 570 nm, mientras se utilizan 600 nm como longitud de onda de referencia. Sin embargo, tiende a ser menos sensible porque hay una superposición considerable de las formas oxidadas y reducidas del alamarBlue® cuando se mide por absorbancia).
La reducción de alamarBlue® por las células expresada como unidades de intensidad de emisión de fluorescencia se midió en días 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 y 17 del período de cultivo para diferentes muestras. El % de reducción de alamarBlue® para cada caso se calculó utilizando la fórmula