This results in colorimetric (absorbance) and fluorescence changes. La résazurine est bleue et non fluorescente tandis que la résorufine est rouge et très fluorescente. Il s’agit d’un dosage sensible si l’on travaille avec des cellules supérieures à 5×103 pour 100 µL, relativement non toxique et à condition qu’il soit effectué avec soin, les mêmes répliques peuvent être suivies sur plusieurs points temporels. L’inconvénient de ce test est qu’il ne s’agit pas d’une technique de comptage cellulaire direct comme l’heamocytométrie, car le signal de fluorescence ou d’absorbance peut être affecté à la fois par les changements du nombre de cellules et du métabolisme cellulaire.
Matériaux & Méthodes
- 96 des microplaques de polystyrène noir (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- Lecteur de microplaques BMG LABTECH
Des cellules d’Ostéoblastes humains à passage précoce (HOb 406-05a), fournies par la Collection Européenne de Cultures Cellulaires ECACC ont été ensemencées sur des substrats A et B à une densité de 104 par échantillon. Les échantillons ont été placés chacun dans un puits d’une plaque de 24 puits, recouverts de 1 ml de milieu de culture et incubés pendant 17 jours au total. Le milieu de culture était le milieu 5A de McCoy contenant 10% de sérum inactivé par la chaleur, 1% de glutamine et de vitamine C (30 µg/mL).
Pour mesurer la prolifération cellulaire, les substrats ensemencés ont été incubés pendant 4 heures (des temps d’incubation plus longs peuvent être utilisés pour une plus grande sensibilité) avec un milieu de culture frais additionné d’alamarBlue® à 10% en volume. Un total de 10 répliques ont été utilisées pour chaque substrat.
Après incubation, 100 µL de milieu de chaque puits ont été transférés sur une microplaque de polystyrène noir à 96 puits et répliqués 3 fois. La fluorescence (excitation 530 nm, émission 590 nm) a été mesurée sur un lecteur de microplaques BMG LABTECH. (Remarque: La détection colorimétrique peut être surveillée par des mesures d’absorbance à 570 nm, tout en utilisant 600 nm comme longueur d’onde de référence. Cependant, il a tendance à être moins sensible car il y a un chevauchement important des formes oxydées et réduites de l’alamarBlue® lorsqu’il est mesuré par absorbance).
La réduction d’alamarBlue® par les cellules exprimées en unités d’intensité d’émission de fluorescence a été mesurée sur des jours 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 et 17 de la période de culture pour différents échantillons. Le % de réduction d’alamarBlue® pour chaque cas a été calculé en utilisant la formule