dit resulteert in colorimetrische (absorptie) en fluorescentie veranderingen. Resazurin is blauw en niet-fluorescerend terwijl resorufin rood en hoogst fluorescerend is. Het is een gevoelige assay als het werken met hoger dan 5×103 cellen per 100 µL, relatief niet-toxisch en op voorwaarde dat het zorgvuldig wordt uitgevoerd, dezelfde replicaten kunnen worden gevolgd over meerdere tijdpunten. Het nadeel van deze analyse is dat het geen directe celtelling techniek zoals heamocytometry is, omdat het fluorescentie-of absorptiesignaal door zowel veranderingen in celaantal als celmetabolisme kan worden beà nvloed.
materialen & methoden
- 96 microplaten van zwart polystyreen (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH-microplaatlezer
Early passage menselijke Osteoblastcellen (HOb 406-05a), geleverd door de European Collection of Cell Cultures ECACC, werden op substraten A en B gezaaid met een dichtheid van 104 per monster. De monsters werden elk in een put van een 24-Wells plaat geplaatst, bedekt met 1 ml kweekmedium en gedurende in totaal 17 dagen geïncubeerd. Het kweekmedium was McCoy ‘ s 5A-medium met 10% warmte-geïnactiveerd serum, 1% glutamine en vitamine C (30 µg/mL).
om de celproliferatie te meten, werden de ingezaaide substraten gedurende 4 uur geïncubeerd (langere incubatietijden kunnen worden gebruikt voor een grotere gevoeligheid) met vers kweekmedium aangevuld met 10 vol% alamarBlue®. Voor elk substraat werden in totaal 10 replica ‘ s gebruikt.
na incubatie werd 100 µL medium uit elk putje overgebracht naar een 96-putje zwart polystyreen microplaat en 3 maal gerepliceerd. De fluorescentie (excitatie 530 nm, emissie 590 nm) werd gemeten met een BMG LABTECH microplaatlezer. (Opmerking: colorimetrische detectie kan worden gecontroleerd door absorptiemetingen bij 570 nm, terwijl 600 nm als referentiegolflengte wordt gebruikt. Het is echter meestal minder gevoelig omdat er een aanzienlijke overlap van de geoxideerde en gereduceerde vormen van de alamarBlue® wanneer gemeten door absorptie).
de alamarBlue® – reductie door de cellen, uitgedrukt als fluorescentie-emissie-intensiteitseenheden, werd gemeten op dagen 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 en 17 van de kweekperiode voor verschillende monsters. De % reductie van alamarBlue® voor elk geval werd berekend met de formule