powoduje to zmiany kolorymetryczne (absorbancja) i fluorescencyjne. Resazurin jest niebieski i nie fluorescencyjny, podczas gdy resorufin jest czerwony i wysoce fluorescencyjny. Jest to wrażliwy test, jeśli praca z więcej niż 5×103 komórek na 100 µL, stosunkowo nietoksyczny i pod warunkiem, że jest przeprowadzana ostrożnie, te same replikaty można śledzić w kilku punktach czasowych. Wadą tego testu jest to, że nie jest to technika bezpośredniego liczenia komórek, jak heamocytometria, ponieważ na fluorescencję lub sygnał absorbancji mogą wpływać zarówno zmiany liczby komórek, jak i metabolizmu komórek.
materiały & metody
- 96 well Black polystyrene microplates (Greiner Bio-One)
- alamarBlue® (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH microplate reader
wczesne przejścia ludzkie komórki osteoblastów (HOb 406-05a), dostarczone przez European Collection of Cell Cultures ECACC, były wysiewane na substraty a i B o gęstości 104 na próbkę. Próbki umieszczano w studzience z 24-studzienkowej płytki, pokrytej 1 ml pożywki hodowlanej i inkubowano łącznie przez 17 dni. Pożywką do hodowli była pożywka 5A zawierająca 10% surowicy inaktywowanej termicznie, 1% glutaminy i witaminę C (30 µg/mL).
aby zmierzyć proliferację komórek, wysiewane substraty inkubowano przez 4 godziny (dla większej czułości można zastosować dłuższe czasy inkubacji) ze świeżym podłożem hodowlanym uzupełnionym 10% obj.alamarBlue®. W sumie zastosowano 10 replikatów dla każdego podłoża.
po inkubacji 100 µL pożywki z każdej studzienki przeniesiono do 96-studzienkowej mikropłytki z czarnego polistyrenu i replikowano 3 razy. Fluorescencję (wzbudzenie 530 nm, emisja 590 nm) mierzono na czytniku mikropłytek BMG LABTECH. (Uwaga: Detekcja kolorymetryczna może być monitorowana przez pomiary absorbancji przy 570 nm, przy użyciu 600 nm jako długości fali odniesienia. Jednak jest on mniej wrażliwy, ponieważ występuje znaczne nakładanie się utlenionych i zredukowanych form alamarBlue® mierzonych absorbancją).
redukcję alamarBlue® przez komórki wyrażoną jako jednostki intensywności emisji fluorescencji mierzono w dniach 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 i 17 okresu hodowli dla różnych próbek. Redukcję % alamarBlue® dla każdego przypadku obliczono według wzoru