dette resulterer i kolorimetriske (absorbans) og fluorescensændringer. Resorufin er blåt og ikke-fluorescerende, mens resorufin er rødt og meget fluorescerende. Det er et følsomt assay, hvis man arbejder med mere end 5h103 celler pr.100 liter, relativt ikke-toksisk, og forudsat at det udføres omhyggeligt, kan de samme replikater følges over flere tidspunkter. Ulempen ved dette assay er, at det ikke er en direkte celletællingsteknik som heamocytometri, fordi fluorescens-eller absorbanssignalet kan påvirkes af både ændringer i celletal og cellemetabolisme.
materialer & metoder
- 96 brøndsorte polystyrenmikroplader (Greiner Bio-One)
- alamarBlue Larus (MorphoSys UK)
- BMG LABTECH mikropladelæser
tidlig passage humane osteoblastceller (HOb 406-05A), leveret af Den Europæiske samling af cellekulturer ECACC blev podet på substrater A og B med en densitet på 104 PR.prøve. Prøverne blev hver anbragt i en brønd på en 24-brøndsplade, dækket med 1 ml dyrkningsmedium og inkuberet i i alt 17 dage. Dyrkningsmediet var McCoy ‘ s 5A-medium indeholdende 10% varmeinaktiveret serum, 1% glutamin og C-vitamin (30 g/mL).
for at måle celleproliferation blev de seedede substrater inkuberet i 4 timer (længere inkubationstider kan anvendes til større følsomhed) med frisk dyrkningsmedium suppleret med 10 vol% alamarBlue liter. I alt 10 replikater blev anvendt til hvert substrat.
efter inkubation blev 100 liter-medium fra hver brønd overført til en 96-brønds sort polystyrenmikroplade og replikeret 3 gange. Fluorescens (spænding 530 nm, emission 590 nm) blev målt på en BMG LABTECH mikropladelæser. (Bemærk: kolorimetrisk detektion kan overvåges ved absorbansmålinger ved 570 nm, mens du bruger 600 nm som referencebølgelængde. Det har dog en tendens til at være mindre følsomt, fordi der er betydelig overlapning af de iltede og reducerede former for alamarBlue-Larsen målt ved absorbans).
alamarBlue-reduktion af cellerne udtrykt som fluorescensemissionsintensitetsenheder blev målt på dage 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15 og 17 af kulturperioden for forskellige prøver. % – Reduktionen af alamarBlue-kalk for hvert tilfælde blev beregnet ved hjælp af formlen